DNA proovid

    Enamuse molekulaar-tsütogeneetiliste uuringute (v.a. näiteks võrdlev genoomne ISH) jaoks on vaja informatiivseid proove. Kasutatakse unikaalse DNA, korduvjärjestuste ja kromosoomi-spetsiifilisi proove.
    Unikaalse DNA proovid. Unikaalsete järjestuste proovide hulka kuuluvad genoomse DNA, cDNA ja oligonukleotiidsed proovid. Genoomsed proovid on spetsiifiliste lookuste DNA järjestused, cDNA proovid pärinevad aga ekspresseerunud geeni eksonite järjestustest. Genoomse DNA ja cDNA proovid on suhteliselt pikad ja komplementaarsed kogu geenile või selle teatud osale, oligote proovid on aga lühikesed DNA järjestused, tavaliselt 17-25 bp pikad, keemiliselt sünteesitud ja üheahelalised. 
    Korduvjärjestuste proovid. Tandeemselt palju korratud järjestuste (näiteks alfa-satelliit DNA) proovid olid ühed esimesed, mida kasutati molekulaar-tsütogeneetilistes uuringutes. Need proovid ei sisalda hajuskordusi ning kuna lihtne (lühike) järjestus on väga palju kordi korratud, siis annavad nad intensiivse hübridisatsioonisignaali metafaasi kromosoomide vastavates piirkondades ning interfaasi tuumas. Analüüsil tuleb aga arvestada, et korduvjärjestuste alade suurus kromosoomides varieerub (vt. kromosoomide polümorfism). Tsentromeerse alfa-satelliit DNA proovid on olemas kõigi inimese kromosoomide jaoks, vaid 5., 13. ja 21. kromosoomi proovid rist-hübridiseeruvad in situ.
    Kromosoomi-proovid. Kromosoomi- ja kromosoomiala-spetsiifilised proovid koosnevad terve kromosoomi või selle mingi ala paljudest erinevatest DNA fragmentidest. Hübridiseerimisel katab proov märklaud-piirkonna enam-vähem täielikult. Kromosoomi-proovid saadakse kloneeritud või PCR raamatukogudena (libraries) kas rakusorteri abil eraldatud kromosoomidest või mikrotükeldamisel saadud kromosoomiosast. 
    Kromosoomide sorteerimine läbivoolu tsütofluorimeetri e. rakusorteriga (fluorescence activated cell sorter, FACS) põhineb DNA-spetsiifilise fluorokroomi ergastamisel laserkiirega. Värvitud kromosoomid suunatakse lahuses läbi kapillaari, kus iga üksiku kromosoomi hiilgus mõõdetakse ja nad vastavalt hiilguse intensiivsuse mustrile eraldatakse (näiteks eraldatakse kõik 5. kromosoomid). Sorteeritud kromosoome kasutatakse kromosoomi-spetsiifiliste raamatukogude saamiseks. 
    Metafaasi kromosoomide mikrotükeldamine (microdissection) seisneb selles, et G- või R-vöödistatud kromosoomides eemaldatakse mikroskoobi all laserkiirega või mikromanipulaatoriga teatud kromosoomipiirkond (vööt). Kromosoomivöödi-spetsiifiline DNA amplifitseeritakse PCR-iga. 
    Kromosoomi-spetsiifilised raamatukogud on olemas kõigi inimese kromosoomide jaoks, kusjuures enamus neist on proovidena ka kommertsiaalselt kättesaadavad. Taolisi proove kasutatakse aneuploidiate, keeruliste kromosoomiaberratsioonide ja markerkromosoomide identifitseerimiseks. Raamatukogusid on võimalik teha ka aberrantsetest kromosoomidest ning hübridiseerida neid normaalsetele metafaasi kromosoomidele (kromosoomide pöördvärvimine).
    Proovide märgistamine. Proove märgistatakse fluorokroomiga (otsene märgistamine) või retseptormolekuliga (vahendatud märgistamine).
    Proovi otsesel märgistamisel on fluorokroom seotud vahetult nukleotiidi külge. Fluorestseiiniga (FITC) märgistatud nukleotiidid võeti ISH-i puhul kasutusele 1991.a. Kommertsiaalselt on praegu saadaval erinevat värvi fluorokroomidega (fluorestseiin, rodamiin, hüdroksükumariin, tsüaniinvärvid Cy jt.) seotud nukleotiidid (dUTP, dATP jt.). Sellised märgistatud proovid on hübridiseerimisjärgselt kohe detekteeritavad, kuid signaali saab ka võimendada. Selleks kasutatakse fluorokroomi-vastast antikeha (AK), mida detekteeritakse sekundaarse AK-ga, kuhu on omakorda seotud fluorokroom. 
    Proovi vahendatud märgistamisel kasutatakse hapteenitaolisi retseptormolekule nagu biotiin (BIO) või digoksigeniin (DIG). Prooviga seotud biotiini detekteeritakse hübridiseerimisjärgselt fluorokroomiga konjugeeritud avidiini, streptavidiini või BIO-vastase antikehaga. Digoksigeniini detekteerimiseks kasutatakse DIG-vastast antikeha. Proovi märgistamine biotiiniga võeti kasutusele1981. aastal Yale Ülikoolis David Wardi grupi poolt. Biotiin on siiani jäänud kõige enam eelistatuks retseptormolekuliks proovide vahendatud märgistamisel. 
    Proove märgistatakse põhiliselt nik-translatsiooni e. katke ülekande meetodil. Nik-translatsioon (nick translation) on ensümaatiline in vitro DNA süntees, mille käigus üks neljast nukleotiidist (tavaliselt tümidiin) asendatakse kas retseptormolekuli või fluorokroomiga seotud nukleotiidiga (näiteks BIO-dUTP või FITC-dUTP). DNaseI teeb ühte DNA ahelasse katked e. nikid. Katkenud ahela 3´otsa lisab E. coli DNA polümeraasI märgistatud ja märgistamata nukleotiide. Tänu sellele, et E. coli DNA polümeraasI omab ka 5´--3´endonukleaasset aktiivsust, eemaldab ta samal ajal nukleotiide niki 5´ otsast. Kogu protsessi nimetataksegi DNA ahela katke ülekandeks e. nik-translatsiooniks. Proov peab lõpuks koosnema 100-500 bp pikkustest märgistatud DNA fragmentidest. Fragmentide pikkust kontrollitakse agaroos geel-elektroforeesil ning retseptormolekuli inkorporeerumist dot-blot meetodil. 

Proovi hübridiseerimine kromosoomipreparaadil

    In situ hübridisatsiooni optimaalsed tingimused sõltuvad proovi ja märklaud-DNA omadustest. Märklaud-DNA võib pärineda erinevatest organismidest (bakter, äädikakärbes, hiir, inimene jt.), erinevatest kudedest (perifeerne veri, koorion, fibroblastid, kasvajakude jt.) või hoopis rakuliinidest.
    Kromosoomipreparaadi saamiseks kultiveeritakse rakke in vitro, mõjutatakse kolhitsiiniga, hüpotoonilise lahusega ning fikseeritakse metanool:jää-äädikhappega. Kromosoomipreparaate saab FISH-i jaoks kasutada 1 kuu jooksul, -20^o C juures hoituna aga aastaid. 
    Nukleiinhapete hübridiseerimine eeldab, et mõlemad, nii proov kui ka märklaud-DNA, peavad olema üheahaelalised. Seega tuleb enne hübridiseerimist proovi DNA ning kromosoomi DNA denatureerida. Kromosoomi DNA denatureeritakse 70^oC juures 70% formamiid/2xSSC-s. Proovi DNA viiakse koos kandja- ja konkurent-DNA-ga hübridiseerimispuhvrisse (50% formamiid/dekstraansulfaat/ 2xSSC) ja denatureeritakse 70^oC juures. Seejärel kantakse proov kromosoomipreparaadile ning kaetakse katteklaasiga. Kui proov ei sisalda hajuskordusi, võib teda denatureerida ka koos kromosoomi DNA-ga. Proov hübridiseeritakse kromosoomipreparaadile niiskes kambris 37^o C juures vähemalt üleöö. Mida suurem on proovi kontsentratsioon ja mida ulatuslikumat ala ta katab, seda kiirem on hübridisatsioon. Tänu formamiidi ja dekstraansulfaadi kasutamisele on hübridiseerimist võimalik läbi viia suhteliselt madalal temperatuuril, mis on tähtis kromosoomide morfoloogia säilimiseks. Olulised on veel proovi kontsentratsioon, pikkus ja pesemislahuste koostis. Hübridisatsioonijärgnselt pestakse preparaate 50% formamiidis/2xSSC-s ja madala kontsentratsiooniga soolalahuses 37-45^o C juures. 
   CISS-hübridiseerimine. Kui proov sisaldab Alu või LINE järjestusi, siis ta rist-hübridiseerub kõigi kromosoomide hajuskorduste aladega ja kromosoomid värvuvad FISH-il ühtlaselt. Et seda ära hoida, tuleb proovis olevad hajuskordused siduda. Selleks eel-hübridiseeritakse proovi DNA sama liigi märgistamata DNA-ga, nn. konkurent-DNA-ga (competitor DNA). Konkurent-DNA hübridiseerub proovi hajuskordustega ning proov saab seejärel juba spetsiifiliselt hübridiseeruda vastavasse kromosoomipiirkonda. Taolise lähenemise võttis 1987.a. kasutusele J.E.Landegen ja seda nimetatakse kromosomaalseks in situ supressiooniks (chromosomal in situ suppression, CISS). Hübridiseerimist, kus CISS-i kasutatakse, aga vastavalt CISS-hübridiseerimiseks. Konkurent-DNA-na kasutatakse kas DNA korduvjärjestuste fraktsiooni (Cot1 DNA) või sama liigi genoomset DNA-d. Et DNA hulk oleks suurem, lisatakse proovile ka kandja-DNA (carrier DNA), milleks on tavaliselt heeringa või lõhe spermi DNA. Mida pikem ja keerulisem on proov (plasmiid--faag--kosmiid--YAC--kromosoomi raamatukogu), seda suurem on vajadus CISS-hübridiseerimise järele.
    Praimeritega in situ märgistamine e. PRINS (PRimed IN Situ labeling või ka oligonucleotide primed in situ DNA synthesis, PRINS) võeti kasutusele 1987. aastal J.Kochi jt. poolt. Meetod seisneb märgistamata oligode hübridiseerimisel in situ märklaud-DNA või -RNA-ga. Hübridisatsiooni-keskkonda lisatakse spetsiifiline oligonukleotiidne praimer, DNA polümeraas ning märgistamata ja fluorokroomiga märgistatud nukleotiidid. DNA ahela sünteesi käigus märgistub kromosoomi DNA in situ. Märgis on hübridiseerimisjärgselt detekteeritav fluorestsents-mikroskoobis. PRINS-i eelisteks on lühike analüüsi aeg (alla tunni) ja suur spetsiifilisus, kuna proovi märgistamine toimub hübridiseerimise käigus. DNA ahela pikenemine ei sõltu praimeri pikkusest - oligonukleotiidid indutseerivad sama intensiivse märgistamise kui näiteks palju pikemad korduvjärjestuste proovid. PRINS-i kasutataksegi edukalt alfa-satelliit DNA järjestuste lokaliseerimiseks metafaasi kromosoomides ja interfaasi tuumades. Oligonukleotiide on mõningase eduga hübridiseeritud in situ ka unikaalsetele järjestustele. PRINS-i tavaline lahutus on 2.5-5 kb, kuid on detekteeritud ka umbes 600 bp pikkusi märklaud-DNA järjestusi. 

Signaali detekteerimine ja lokaliseerimine

    Kui hübridiseerimiseks kasutada sellist proovi, kus fluorokroom on seotud nukleotiidi külge, siis saab märgist pärast hübridiseerimist kohe detekteerida fluorestsents- või konfokaalmikroskoobis . Fluorokroomidest on laialdaselt kasutusel fluorestseiin (FITC), rodamiin (TRITC), AMCA, Texase punane ja terve paneel uusi tsüaniinvärve (Cy2, Cy3, Cy5, Cy7 jt.). FITC annab rohelise, Texase punane ja TRITC punase ning AMCA sinist värvi signaali. Signaali saab vajadusel ka võimendada, kui kasutada antud fluorokroomi vastast antikeha, mida detekteeritakse sekundaarse AK-ga, kuhu on omakorda seotud fluorokroom.
    Retseptormolekul-vahendatud märgistamise puhul tuleb pärast in situ hübridiseerimist retseptormolekul täiendavalt detekteerida. Selleks kasutatakse retseptormolekuli suhtes afiinset molekuli, mille külge on seotud fluorokroom. Näiteks kui proov on seotud biotiiniga, siis detekteeritakse märgis fluorokroomiga konjugeeritud avidiini, streptavidiini (omavad väga suurt afiinsust biotiini suhtes) või BIO-vastaste antikehadega. Kui proov on aga seotud digoksigeniini või mõne teise retseptormolekuliga, siis kasutatakse nende retseptormolekulide vastaseid spetsiifilisi antikehi, mis on konjugeeritud fluorestseiiniga, rodamiiniga või mõne teise fluorokroomiga. Kui signaali detekteerimisel kasutatakse fluorokroomi, siis on see fluorestsents in situ hübridisatsioon e. FISH (fluorescence in situ hybridization, FISH).
    Fluorokroomi asemel võib kasutada ka aluselist fosfataasi või peroksüdaasi. Sellisel juhul pole tegemist FISH-i vaid ensüüm-vahendatud in situ hübridisatsiooniga e. EISH (enzyme-linked in situ hybridization, EISH). Signaali saab ka amplifitseerida. Kui proovi detekteerimisel kasutati näiteks avidiin-FITC-i, siis tuleb preparaati täiendavalt inkubeerida biotinileeritud avidiini-vastase antikehaga ning seejärel jälle avidiin-FITC-ga. Neid reaktsioone võib mitmeid kordi korrata. 
    Mittemärgistunud alade esiletoomiseks värvitakse kromosoomipreparaat üle DNA-seoselise värviga: enamkasutatavamad on propiidiumjodiid (PI) (punane) või DAPI (sinine). Värv valitakse proovi detekteerimiseks kasutatud fluorokroomist spektraalselt erinev ning mikroskopeerimisel kasutatakse vastavaid filtreid. Analüüsi lihtsustab kindlasti CCD-kaamera ja digitaalse andmetöötluse kasutamine. 
    FISHi-järgseks kromosoomide identifitseerimiseks ja proovi lokaliseerimiseks kasutatakse traditsioonilisi Q-, G- või R-vöödistusi. Suurem lahutus saadakse siis, kui FISH on läbi viidud prometafaasi kromosoomidel. Signaali lokaliseerimine on kõige lihtsam juhul, kui hübridiseerimissignaal on nähtav samaaegselt kromosoomivöödistusega. Kromosoomivöödistuse annavad ka märgistatud Alu või LINE hajuskordused, kui neid koos teisti märgistatud prooviga samaaegselt hübridiseerida. Kromosoome saab identifitseerida ka ilma neid vöödistamata, hübridiseerides näiteks meid huvitavat proovi koos sellest erinevalt märgistatud alfa-satelliit DNA prooviga.

Radioaktiivne ja mitteradioaktiivne ISH

    Radioaktiivne in situ hübridisatsioon (radioactive in situ hybridization) kromosoomipreparaadil võeti kasutusele 1969. aastal M.L.Pardue ja J.G.Gall´i ning B.John´i jt. poolt. 70. aastatel märgistati nukleiinhappeid isotoopidega ja hübridiseerunud järjestusi detekteeriti autoradiograafiliselt. Kuna tol ajal DNA-d veel ei kloneeritud, siis piirdus ISH nukleiinhappe-järjestuste nagu satDNA ja rRNA hübridiseerimisega. Neid  sai isoleerida tavaliste biokeemiliste meetoditega . 80. aastatel hakati radioaktiivse märgisega ISH-i kasutama juba mõnesaja aluspaari pikkuste plasmiidi vektorisse kloneeritud unikaalsete DNA järjestuste ning mRNA lokaliseerimiseks kromosoomipreparaadil. Mõned aastad tagasi võeti kasutusele keemiliselt sünteesitud ja radioaktiivselt märgistatud oligonukleotiidid, mida kasutatakse esmajoones mRNA in situ detekteerimiseks. 
    Meetodi põhimõte on järgmine. Proov (näiteks kloneeritud DNA järjestus) märgistatakse triitiumiga [³H], fosforiga [³²P] või joodiga [¹²⁵I], denatureeritakse kõrgel temperatuuril ning hübridiseeritakse denatureeritud metafaasi kromosoomidele. Pärast pesemisi kaetakse kromosoomipreparaat fotoemulsiooniga ning inkubeeritakse veel paar-kolm nädalat pimedas. Integreerunud radioaktiivne märgis indutseerib hõbedagraanulite tekke fotoemulsioonis, kusjuures graanulite hulka saab hinnata kvantitatiivselt. Tavaliselt tekib ka teatud hulk nn. fooni hõbedagraanuleid; seetõttu kasutatakse paljude rakkude statistilist analüüsi, leidmaks kõige enam märgistunud kromosoomipiirkonda. 
    Praegu pole radioaktiivne ISH eriti populaarne, kuna töös tuleb kasutada isotoope ning autoradiograafia võtab väga kaua (nädalaid) aega. Radioaktiivne märgis on suhteliselt suur ja see piirab märgistatud proovi lahutust kromosoomidel, segab ka tugev foonimüra.
    Mitteradioaktiivne in situ hübridisatsioon e. NISH (non-radioactive in situ hybridization, NISH) on kasutusel 80. aastate algusest, kui proove hakati märgistama biotiiniga ja töötati välja (D.C.Ward, P.R.Langer, D.Pinkel jt.) tundlikud märgise detekteerimise süsteemid. Proovide märgistamine hapteenitaoliste retseptormolekulidega kõrvaldas põhilised raskused, mis piirasid in situ hübridisatsiooni rakendamist ja pani aluse tsütogeneetika tormilisele arengule. NISH võimaldab kombineerida erinevaid märgiseid ning detekteerida neid mikroskoobis samaaegselt. Erinevalt radioaktiivsest ISH-ist ei võta kogu protseduur üle päeva-paari aega. Seetõttu on viimastel aastatel isotoopidega märgistatud proovid asendunud mitte-radioaktiivsete proovidega ja radioaktiivne ISH mitteradioaktiivse ISH-iga.
   Mitteradioaktiivse ISH-i puhul kasutatakse kahte moodi märgistatud proove. Kui fluorokroom on seotud vahetult nukleotiidile, siis saab proovi kohe pärast hübridiseerumist kromosoomides või interfaasi tuumades visualiseerida. Teisel juhul seotakse proov retseptormolekuliga, mida tuleb hübridiseerimisjärgselt immuunotsütokeemiliselt detekteerida. Kui detekteerimisel kasutatakse flourokroomi, on tegemist FISH-iga, kui retseptormolekul detekteeritakse aluselise fosfataasi või peroksüdaasiga konjugeeritud antikehaga, siis nimetatakse seda EISH-iks.

Mitmevärvi FISH 

    Paljude hübridisatsioonidomäänide samaaegset visualiseerimist kromosoomides nimetatakse kromosoomide värvimiseks (chromosome painting). Kromosoomid värvitakse erinevalt märgistatud proovide in situ hübridiseerimisel kromosoomipreparaadile e. mitmevärvi-FISH-i meetodil (multicolor FISH). Kromosoomide värvimine võimaldab sarnaselt kromosoomivöödistustele kogu karüotüübi analüüsi korraga. “Vöödid” on sel juhul määratletud vastavate DNA proovide in situ hübridiseerimisel metafaasi kromosoomidele ja tulemust võiks nimetada molekulaarseks karüotüübiks (molecular karyotype). Kromosoomide koloreerimisel jääb lahutus 2-3 Mb piiridesse. 
    90. aastate alguses modifitseeriti FISH-i nii, et samaaegselt sai kasutada mitut erinevalt märgistatud  DNA proovi ning erinevate fluorokroomidega märgistatud detekteerimissüsteeme (P.M.Nederlof jt.). Kolme värvi kombineerimisel teatud vahekordades oli 1992.a. võimalik korraga värvida juba 7 kromosoomi ja 1994.a. 12 kromosoomi. Mitmevärvi-FISH eeldab fluorestsentsmikroskoobi, spetsiaalsete filtrite, CCD-kaamera ja digitaaltöötluse programmide olemasolu.
    Täiesti uus etapp mitmevärvi-FISH-i arengus algas 1996.aastal, kui kaks uurimisgruppi USA-s - Yale Ülikoolist (M.S.Speicher, D.C.Ward jt.) ning National Institutes of Health (NIH) konsortsium (E.Schröck, T.Ried jt.) pakkusid välja võimalused kogu karüotüübi värvimiseks nii, et kõik kromosoomid on värvi järgi identifitseeritavad. Meetodid põhinevad kombinatiivsel proovide märgistamisel spektraalselt eristatavate fluorokroomide värvikombinatsioonide saamiseks. N värvi kombinatsioonide arv on 2^N-1; seega piisab inimese 24 kromosoomi värvimiseks 5 erinevast fluorokroomist (2⁵-1=31 võimalust). 5 värvi ja nende kombinatsioonide eristamiseks on uurimisgrupid kasutanud erinevaid lähenemisi. 
    Yale grupp pakkus välja M-FISH-meetodi (multiplex fluorescence in situ hybridization, M-FISH). Kõigepealt detekteeritakse kõik viis fluorokroomi eraldi läbi vastavate optiliste filtrite. CCD-kaamera abil detekteeritud signaalid digitaliseeritakse. Seejärel liidetakse vastava arvutiprogrammi abil iga kromosoomi kohta saadud värvide kombinatsioonid ning kromosoomidele antakse kindel värving.
    NIH-konsortsium rakendas värvide eristamiseks spektraalse karüotüpeerimise e. SKY-meetodit (spectral kartotyping, SKY), kus CCD-kaamera vahendusel saadud kujutise analüüsil kasutatakse Fourieri spektroskoopia printsiipe. Kromosoomide värvimisel kasutatakse korraga väga paljusid spektraalselt kattuvaid DNA proove (näiteks inimese molekulaarse karüotüübi saamiseks 23 või 24 proovi). Iga proovi neeldumisspekter mõõdetakse eraldi ning seejärel rakendatakse spetsiaalset arvutiprogrammi, mis spektraalsete erinevuste algoritmide põhjal annab igale kromosoomile kindla värvuse (koloriidi).

Võrdlev genoomne ISH

    Võrdlev genoomne in situ hübridisatsioon e. CGH (comparative genomic in situ hybridization, CGH) põhineb kromosoomide pöördvärvimise ideel. Kromosoomide pöördvärvimise puhul hübridiseeritakse markerkromosoomist saadud proov normaalsetele metafaasi kromosoomidele. Komplementaarsete alade värvumine normaalsetes kromosoomides võimaldabki aberrantse kromosoomi identifitseerida. Kui kromosoomide pöördvärvimisel kasutada proovina kogu genoomi DNA-d (näiteks kasvajaraku DNA-d), mis hübridiseeritakse normaalsetele kromosoomidele, siis ongi see võrdlev genoomne in situ hübridisatsioon. CGH-meeetodi võttis kasutusele O.-P.Kallioniemi et al. 1992. aastal. 
    Võrdlev genoomne ISH viiakse läbi järgmiselt. Kasvajarakkudest saadud ja märgistatud genoomne DNA (test-genoom) segatakse normaalsetest rakkudest saadud ja teisiti märgistatud genoomse DNA-ga (kontroll-genoom) vahekorras 1:1. Saadud proov CISS-hübridiseeritakse märgistamata normaalsetele kromosoomidele. Proovid detekteeritakse erinevate fluorokroomidega (näiteks FITC ja TRITC) seotud afiinsete molekulidega. Fluorokroomide hiilgus mõõdetakse ja iga kromosoomi või kromosoomisegmendi jaoks saadakse FITC/TRITC hiilguse intensiivsuste suhe e. FR (fluorescence ratio), mis peegeldabki kromosoomide või nende alade esindatust test-genoomis kontroll-genoomi suhtes. Geneetilise materjali üle- või alaesindatuse hindamiseks kasutatakse FR-i mõõtmist ning suure hulga CGH-metafaaside statistilist analüüsi. Kui mingi kromosoomi osas saadakse FR-väärtuseks 0.5, siis on tegemist monosoomiaga, hiilguse suhe 1.5 näitab trisoomiat ja 1.0 disoomiat e. kahe koopia olemasolu. Kromsoomide kadumist või lisandumist saab kindlaks teha ka ainult test-genoomi DNA CISS-hübridiseerimisel normaalsetele kromosoomidele. Teisiti märgistatud kontroll-DNA lisamine test-DNA-le kindlustab aga selle, et tasakaalustamata (monosoomiad, trisoomiad) ja tasakaalustatud (disoomiad) kromosoomide kohta saadakse selgelt erinevad spetsiifilised FR-väärtused.
    CGH-meetodi eelisteks teiste ISH-i meetodite ees on see, et kromosoomide lisandumist või kadumist saab test-genoomis hinnata ilma kromosoomipreparaati tegemata. See on eriti oluline soliidkasvajate puhul, kus sageli ei õnnestugi head kromosoomipreparaati saada. Meetodi puuduseks on aga kindlasti see, et hinnata saab vaid kromosoomimaterjali lisandumist ja kadu, mitte aga ümberpaigutumist (translokatsioonid ja inversioonid jäävad avastamata). Ja veel, test-DNA-s on aneuploidiaid jt. anomaaliaid võimalik kindlaks teha vaid siis, kui need esinevad enamuses rakkudes; igal juhul jääb avastamata klonaalne heterogeensus, mis kasvajakoes on üsna tavaline.
    Minimaalset kromosoomimaterjali lisandumist või kadu, mida saab CGH-meetodil veel kindlaks teha, hinnatakse praegu >10 Mb-le. See on tegelikult väga väike lahutus. Antud meetod vajab edasist täiendamist ja omab suurt perspektiivi, seda eriti kasvajate tsütogeneetikas.
    ZOO-FISH (ZOO FISH) on CGH protokollil põhinev meetod määratlemaks erinevate liikide kromosoomide homoloogiat. Kõige väiksem sünteenne kromosoomisegment, mida saab CGH-meetodil hinnata on umbes 7 Mb. Oluliselt laiendab ZOO-FISH-i võimalusi CGH-meetodi kombineerimine videomikroskoopia ning mitmevärvi-FISH-iga. Siis jääb lahutus paari megaaluspaari piiridessse. Kui kasutada kromosoomi- või kromosoomiala-spetsiifilisi proove, saab uurida teatud kindlate kromosoomipiirkondade homoloogiat. Võrdlevate kromosoomikaartide koostamine võimaldab määratleda evolutsioonilisi seoseid organismide rühma sees ja rekonstrueerida eellaste karüotüüpe (ancient karyotype). ZOO-FISH-meetodit kasutatakse karüotüübi evolutsiooni uuringutes.

Kõrglahutus-FISH

    Kui FISH viia läbi profaasi kromosoomidel, saadakse 3-4 korda suurem lahutus kui metafaasi kromosoomidel. Interfaasi kromosoomid on aga profaasi kromosoomidest omakorda mitmeid kordi pikemad, mistõttu nendes saab lähestikku paiknevaid DNA järjestusi veel paremini eristada ja reastada (kaardistada). Põhiküsimuseks on kõrglahutus-FISH analüüsi võimaldava kromatiinipreparaadi saamine. 
    Üheks dekondenseerunud kromosoomide preparaadi saamise võimaluseks on tuuma ekstraktsiooni e. DNA halo-meetod (nuclear extraction technique or DNA halo technique). Meetodi töötas välja J.Wiegant et al. 1992. aastal eesmärgiga suurendada interfaasi FISH-i täpsust ja lahutust. DNA halo-meetod võimaldab saada pikki väljaulatuvaid DNA lingusid (loops), mis tekivad halo-sarnaselt (halo-like) tuuma maatriksi ümber. Halo-preparaadil saab FISH-i abil lokaliseerida kõrvutiasuvaid ja kattuvaid 10-20 kb suurusi kosmiide, mis ületab tavalise interfaasi tuuma FISH-i lahutuse mitmekordselt. 
      Fiiber-FISH-i (fiber-FISH) puhul kasutatakse märklauana kromatiinikiudusid (fiber), mille kondensatsiooniaste on 0.3-0.4 um/kb. Dekondenseerunud kromatiinikiudude preparaate saadakse interfaasi tuumadest halo-meetodil, genoomse või kloonitud DNA sulundamisel agaroosi ja vastaval töötlemisel (Heiskanen et al., 1996) või siis teatud tingimustes eraldatud ja lüüsitud DNA-st. Fiiber-FISH meetod võimaldab koostada kosmiidi kontiigide füüsilisi kaarte lahutusega >1-400 kb. Kui fiiber-FISH-i kombineeerida mitmevärvi-FISH-iga, saab edukalt määrata kosmiidikloonide järjestust kromosoomis. Fiiber-FISH omab suurt tähtsust kosmiidide ja YAC-de kattumiste analüüsil, kõrvutiasetsevate kontiigide vaheliste gäppide määramisel ning samuti mikrodeletsioonide ja väikeste duplikatsioonide kindlakstegemisel.
    Sirutatud kromosoomide meetod (extended chromosomes). Kui rakke sünkroniseerida ja peatada mitoos profaasis või varases metafaasis, siis saadakse pikad vähekondenseerunud kromosoomid. Kuna kromosoomid säilitavad niiskes keskkonnas elastsuse, siis on võimalik  neid tsütotsentrifuugimisel veel 5-10 korda pikemaks venitada (sirutada). Mehhaaniliselt sirutatud kromosoome e. MSC (mechanically streched chromosomes, MSC) kasutatakse nii YAC-kloonide kui ka geenide järjestuse kindlakstegemiseks. 

"Värviajastud"

    Tsütogeneetika on, nagu M.R.Speicher ja D.Ward tabavalt kirjeldavad, arenenud läbi "värviajastute" (progression of "color ages"). Kromosoomide uurimise esimest ajastut nimetatakse "tsütogeneetika mustaks ajastuks" ("black age of cytogenetics"). See algas 50. aastatel, kui töötati välja meetodid kvaliteetsete kromosoomipreparaatide saamiseks. Tollal kasutati värve, mis värvisid kromosoome ühtlaselt tumedaks, mistõttu fotodel olidki kromosoomid tavaliselt mustad. 70. aastate alguses võeti kasutusele diferentsiaalvärvimise meetodid, mis võimaldavad kromosoome vöödistada ja identifitseerida. Igas kromosoomis ilmneb kindel vöödistuse muster, mille moodustavad erineva suurusega heledad ja tumedad vöödid. Vöödilised kromosoomid kuuluvad "must-valge ajastusse" ("black-and-white age"). 80. aastatel algas "FISH-i ajastu" ("the FISH age"). Kromosoome hakati "värvima" molekulaarsete proovidega, mis lõi suurepärase võimaluse geenikaardistamiseks ning andis täiendava võimaluse kromosoomianomaaliate kindlakstegemiseks nii metafaasi kromosoomides kui ka interfaasi tuumades. Neljas värviajastu - "mitmevärvi ajastu" ("multicolor age") - algas seoses videomikroskoopia rakendamise ja uute värvide väljatöötamisega 90. aastate keskel. Nüüd saab 5 värvi samaaegsel kasutamisel koloreerida ja eristada kõiki inimese 24 kromosoomi.

ISH meditsiinigeneetikas

    In situ hübridiseerimise meetodeid kasutatakse kliinilise geneetika diagnostikalaborites iga päevaga üha rohkem. FISH-i rakendamise eelduseks on proovide kättesaadavus ning kaasaegse aparatuuri (fluorestsents- või konfokaalmikroskoop, CCD-kaamera, arvutiprogrammid jne.) olemasolu. 
    Eriti armastatud on kõikvõimalikud fluorestsents-märgisega ISH-i meetodid ning neid rakendatakse paralleelselt traditsioonilise kromosoomide diferentsiaalvärvimisega. FISH-i abil saab identifitseerida probleemseid derivaat- ja markerkromosoome, teha kindlaks mikrodeletsioone ja krüptilisi translokatsioone ning täpsustada murrukohti. Mitmevärvi-FISH-i kasutatakse edukalt kromosoomianomaaliate diagnoosimiseks koorionibiopsia või amniotsenteesi teel saadud loote rakkudes (interfaasi tuumades). Kasvajate tsütogeneetilisel analüüsil annab võrdlev genoomne ISH võimaluse teha kindlaks trisoomiaid ja monosoomiaid ka juhul, kui kromosoomipreparaati pole õnnestunud saada.
    Markerkromosoome saab identifitseerida kahel põhimõtteliselt erineval moel. Võib kasutada (normaalsete) kromosoomide spetsiifilisi proove ja hübridiseerida neid aberrantsetele metafaasi kromosoomidele. Seda nimetatakse kromosoomide õigetpidi värvimiseks e. FCP (forward chromosome painting, FCP). Sel juhul kasutatakse erinevate normaalsete kromosoomide proove meid huvitava markerkromosoomi identifitseerimiseks n.ö. katse-eksituse meetodil. Tavaliselt analüüsitakse karüotüüp enne FISH-i kromosoomivöödistuse meetoditega ning valitakse tõenäolised proovid. Eelinfo puudumisel võib aga markerkromosoomi identifitseerimine FCP-ga aeganõudvaks osutuda. Teise lähenemise, kromosoomide pöördvärvimise e. RCP (reverse chromosome painting, RCP), põhimõte seisneb selles, et markerkromosoomist tehkse proov, märgistatakse ja hübridiseeritakse normaalsetele metafaasi kromosoomidele. Värvuvad proovile (markerkromosoomile) vastavad alad normaalsetes kromosoomides (mõlemas homoloogis).
    Interfaasi tuumas on võimalik aneuploidiaid identifitseerida nii kromosoomi-, korduvjärjestuste kui ka unikaalsete järjestuste proovidega. Aneuploidiate analüüs kromosoomi-proovidega on tuumas aga raskendatud kromosoomialade kattumise tõttu. Nii näiteks saadakse regulaarse trisoomia (kõigis rakkudes lisakoopia) puhul 3 eristatavat signaali alla 50% rakkudes. Korduvjärjestuste proovid, näiteks tentromeerse alfa-satDNA proovid, annavad interfaasi tuumas paremini lokaliseeritava signaali. Alfa-satelliit DNA proovid on olemas kõigi inimese kromsooomide jaoks. 13. ja 21. kromosoomi tsentromeersete järjestuste homoloogia on aga nii suur, et kõik nende kromosoomide alfa-satDNA proovid rist-hübridiseeruvad. Seetõttu võib normaalsete indiviidide rakutuumades näha nelja ning nii Patau kui ka Downi sündroomi puhul viit hübridisatsioonisignaali, ükskõik kumba neist proovidest FISH-il kasutada. Enamus korduvjärjestuste aladest on polümorfsed ning seetõttu võivad väikesed alfa-satDNA alad jääda interfaaasi tuumas lihtsalt märkamata. Aneuploidiate detekteerimiseks kasutatakse ka sündroomi kriitiliste piirkondade unikaalsete järjestuste proove; näiteks Downi sündroomi diagnoosimiseks on vaja 21q22.3 kromosoomivöödi proovi. FISH-i abil saab interfaasi tuumas identifitseerida ka deletsioone ja translokatsioone. Paraku on vajalik eelinfo oletatava struktuurse aberratsiooni kohta (näiteks on üks vanematest translokatsiooni kandja). Translokatsiooni kindlakstegemiseks on vaja kahte unikaalse DNA järjestuse proovi, mis asuvad murrukohast üks ühel, teine teisel pool. Translokatsiooni korral näeme interfaasi tuumas kahte märgist kõrvutiasuvatena. Deletsiooni kindlakstegemiseks kasutatakse deletsioonialasse kuuluvat unikaalse järjestuse proovi. Deletsiooni korral on tuumades näha vaid üks signaal. Interfaasi FISH dubleeritakse tavaliselt traditsiooniliste kromosoomiuuringutega.
    FISH-i abil on võimalik ka skriinida aneuploidiaid ka ema verest eraldatud loote rakkudes. Loote rakkude hulk ema veres ulatub 10⁵-10⁷; nende hulka kuuluvad lümfotsüüdid, erütrotsüüdid ja tsütotrofoblastid. Ema verest saab loote rakke eraldada näiteks transferriini retseptori (TfR) vastaste antikehade abil FACS-il. TfR ei ole küll spetsiifiline loote rakkudele, kuid TfR-AK-d võimaldavad verest eraldada jagunevaid (st. loote) rakke, mis aktiivselt inkorporeerivad rauda.

ISH geenikaardistamisel

    Fluorestsentsmärgisega in situ hübridisatsioon on üheks kõige efektiivsemaks ja kiiremaks võimaluseks DNA järjestuste kaardistamiseks kromosoomides. FISH-i kasutatakse nii unikaalsete DNA järjestuste lokaliseerimiseks metafaasi kromosoomides kui ka nende vahekauguse ning omavahelise paigutuse kindlakstegemiseks interfaasi tuumades. Põhimõtteliselt on võimalik kaardistada 50-1000 bp pikkusi DNA järjestusi.
    Genoomi kaardistamisel kasutatakse proovidena cDNA-d või unikaalseid järjestusi nii plasmiidi vektoris (1-5 kb), kosmiidis (10-40 kb) kui ka pärmi kunstlikus kromosoomis e. YAC-is (yeast artificial chromosome, YAC) (50-500 kb). Suuremad proovid annavad tugevama hübridiseerimissignaali: näiteks annavad kosmiidi või YAC-i kloneeritud unikaalsed järjestused hästi detekteeritava signaali 80-90% komplementaarsusega kromosoomipiirkonnas. 
 

ISH molekulaar- ja rakubioloogia fundamentaaluuringutes