21. Prokarüootsete geenide regulatsioon

Bakterid on ainuraksed organismid ning puutuvad seetõttu väliskeskkonnaga vahetult kokku. Bakterite geeniregulatsioon on väga operatiivne, võimaldades kiireid ümberlülitusi rakkude metabolismis ja füsioloogilises seisundis. Kui teatavate geenide produkte pole rakkude kasvuks vaja, siis toimub vastavate geenide väljalülitamine, vajaduse korral lülitatakse aga kiiresti tööle need geenid, mille produkte rakk antud olukorras vajab. Selline regulatsioon geenide sisse-välja lülitamise kaudu on rakule ökonoomne ning võimaldab bakteritel optimaalsete kasvutingimuste korral väga kiiresti paljuneda.

Geenide avaldumine prokarüootsetes rakkudes on mitmetasandiline, toimudes nii transkriptsiooni, mRNA metabolismi (mRNA-de protsessing ja degradatsioon), translatsiooni kui ka valkude translatsioonijärgse aktiivsuse regulatsiooni kaudu. Enamus regulatoorseid mehhanisme toimivad siiski transkriptsiooni tasemel. Regulatsioon transkriptsiooni tasemel võib toimuda vastusena keskkonna muutunud signaalidele geenide kiire sisse või välja lülitamise kaudu. Osade geenide puhul toimub nende regulatsioon kaskaadselt, mis seisneb selles, et järgmine rühm geene lülitatakse sisse või välja alles siis, kui on sisse või välja lülitatud eelmine rühm geene. Sellist regulatsioonitüüpi on kirjeldatud detailselt näiteks bakterite sporulatsiooni korral ja bakteriofaagide puhul nende bakterirakus paljunemisel ja morfogeneesis.

Geenide konstitutiivne avaldumine, indutseeritavus ja repressioon

tRNA ja rRNA molekulid, ribosoomi valgud, RNA polümeraasi subühikud ja raku eluks vajalikke metaboolseid protsesse läbiviivad ensüümid on elusraku olulised komponendid ning neid kodeerivad geenid avalduvad rakus pidevalt. Seetõttu nimetatakse neid geene konstitutiivseteks geenideks. Osa geeniprodukte on raku elutegevuseks vajalikud ainult teatud keskkonnatingimuste korral - nende pidev süntees oleks raiskamine. Bakteritel ja bakteriofaagidel on arenenud regulatoorsed mehhanismid, mis võimaldavad geenide avaldumise taset bakterirakus täpselt kontrollida.

Kõige põhjalikumalt on geenide regulatsiooni uuritud bakteri Escherichia coli puhul. Vaatleme järgnevalt, kuidas toimub E. coli geenide regulatsioon näiteks bakterite kasvamisel erinevatel süsiniku allikatel. E. coli on võimeline kasutama süsiniku- ja energiaallikana nii glükoosi, sahharoosi, galaktoosi, arabinoosi kui ka laktoosi. Kui rakkude kasvukeskkonnas leidub glükoosi, siis on glükoosi kasutamine võrreldes teiste substraatidega eelistatud. Glükoosi puudumisel avalduvad aga teised metaboolsed rajad, näiteks laktoosi puhul avalduvad ensüümid, mis võimaldavad bakteritel kasutada kasvuks laktoosi. Laktoosi omastamise seisukohalt on olulised b-galaktosiidi permeaas, mis transpordib laktoosi rakku ja b-galaktosidaas, mis konverteerib laktoosi monosahhariidideks - glükoosiks ja galaktoosiks. Laktoosi puudumisel ning ka siis, kui kasvukeskkonnas on lisaks laktoosile ka glükoosi, neid ensüüme ei sünteesita, kuna see on rakule energeetiliselt kulukas.

Oma looduslikus kasvukeskkonnas leiab E. coli harva kasvuks laktoosi ja seetõttu on laktoosi omastamiseks vajalikud geenid enamasti välja lülitatud. Juhul, kui kasvukeskkonda satub laktoos, toimub nende geenide kiire töölelülitamine. Vastavat protsessi nimetatakse induktsiooniks, sel teel tööle lülitatavaid geene indutseeritavateks geenideks ning nende poolt kodeeritud ensüüme indutseeritavateks ensüümideks. Laktoosi poolt indutseeritud ensüümide aktiivsus jõuab platoole juba 10 minutit pärast laktoosi lisamist kasvukeskkonda. Paljud degradatsioonirajad (kataboolsed rajad) bakterirakus on indutseeritavad. Induktsioon toimub geenide transkriptsiooni tasemel.

Bakterirakus toimub raku kasvuks vajalike komponentide nagu aminohapped, puriinid, pürimidiinid ja vitamiinid süntees. Ka sünteesitavate orgaaniliste molekulide hulk on reguleeritud. Trüptofaani biosünteesiks vajalike ensüümide süntees on kodeeritud viie geeni poolt. Need geenid avalduvad siis, kui rakus pole piisavalt trüptofaani. Juhul, kui kasvukeskkonnas on piisavalt trüptofaani, et tagada rakkude kasv, toimub trüptofaani biosünteesis osalevate ensüümide sünteesi mahasurumine vastavate geenide väljalülitamise teel. Geenide avaldumise pärssimist vastusena keskkonna signaalile nimetatakse repressiooniks. Geenide uuesti tööle lülitamist muutunud olukorras nimetatakse derepressiooniks. Erinevad biosünteetilised rajad bakterirakus on enamasti represseeritavad ning nii nagu ka induktsiooni puhul, toimub regulatsioon transkriptsiooni tasemel.

Bakterite geenid paiknevad koordineeritult reguleeritavates üksustes, mida nimetatakse operonideks

Geenide avaldumise induktsiooni ja repressiooni tagavad mehhanismid on väga sarnased. Neid mehhanisme aitab selgitada operoni mudel. Operoni mudel loodi 1961. aastal Francois Jakob ja Jacques Monod poolt. Nad selgitasid, kuidas toimub E. coli rakkudes laktoosi kasutamist määravate geenide regulatsioon. Operoni mudeli põhjal toimub ühe või mitme järjestikku paikneva struktuurgeeni (geenid, mis kodeerivad ensüümide või struktuurvalkude järjestusi) transkriptsioon kahe kontrolliva elemendi kaudu. Ühte nendest elementidest nimetatakse regulaatoriks või repressorgeeniks, mis kodeerib repressorvalku. Teatud tingimustel on repressor seondunud teise elemendiga, mida nimetatakse operaatoriks. Operaator paikneb alati struktuurgeenide juures. Kui repressor on seotud operaatoriga, siis struktuurgeenide transkriptsiooni ei toimu. Transkriptsioon algab promootorilt, kuhu seondub RNA polümeraas. Promootor paikneb struktuurgeenidest eespool (5´suunas). Kui repressor on seondunud operaatoralaga, takistab see RNA polümeraasi poolt läbiviidavat transkriptsiooni. Operaatorala jääb promootorist geenide poole, kuid mõnedel juhtudel kattub operaatori järjestus osaliselt promootori järjestusega. Regulatoorset üksust, milles paiknevad struktuurgeen(id), operaator ja promootor, nimetatakse operoniks.

Seda, kas repressorvalk seondub operaatoriga ja pärsib struktuurgeenide transkriptsiooni, määrab efektormolekulide olemasolu rakus. Efektormolekulideks on väikesed molekulid nagu näiteks aminohapped või erinevad suhkrumolekulid. Indutseeritava operoni puhul nimetatakse efektormolekuli induktoriks, represseeritavate operonide puhul aga korepressoriks. Efektormolekul seondub repressoriga, muutes tema konformatsiooni ja selle tagajärjel muutub valgu aktiivsus. Indutseeritavaid ja represseeritavaid operone eristab see, kas repressori ja efektori kompleks on võimeline seonduma operaatorile või mitte:

1. Indutseeritava operoni puhul on geenide transkriptsioon pärsitud seetõttu, et induktoriga mitteseondunud repressor on seondunud operaatorile. Efektormolekuli (induktori) seondumine repressoriga muudab selle konformatsiooni nii, et repressor vabaneb operaatoralalt, võimaldades geenide transkriptsiooni. Seega on induktori olemasolul rakkudes vastavate geenide transkriptsioon indutseeritud, sest repressori ja induktori kompleks ei ole võimeline DNA-ga seonduma.

2. Represseeritavate operonide puhul on vastupidi – vaba repressor ei ole võimeline seonduma operaatoriga. Operaatoralale seondub ainult repressori ja efektori (korepressori) kompleks. Seega on represseeritavas operonis paiknevate struktuurgeenide transkriptsioon rakkudes efektormolekuli olemasolul pärsitud.

Kui operonis sisaldub rohkem kui üks struktuurgeen, sünteesitakse mRNA molekul, mis sisaldab informatsiooni kõigi nende geenide kohta. Samas operonis paiknevad struktuurgeenid on koordineeritult reguleeritud ja koos transkribeeritavad. Näiteks trüptofaani operon sisaldab viit erinevat geeni trüptofaani biosünteesiks ja nende transkriptsioon rakus on represseeritud trüptofaani kaudu.

Kuna repressor pärsib struktuurgeenide transkriptsiooni, nimetatakse repressori poolt vahendatud kontrollmehhanismi negatiivseks kontrollmehhanismiks. Lisaks esineb ka positiivne kontrollmehhanism, kus regulaatorvalku on vaja geenide transkriptsiooni aktivatsiooniks. Sellist regulaatorvalku nimetatakse transkriptsiooni aktivaatoriks.

Geenide globaalne regulatsioon bakterites.

Bakterite elukeskkonna tingimused on muutlikud. Muutused, millega näiteks E. coli peab kohanema, on järgmised:

1. Sattumine toitaineterikkast kasvukeskkonnast toitainetevaesesse keskkonda

2. Kasvuks vajaliku C-allika asendumine teisega

3. Aminohapete hulk on limiteeritud

4. Aeroobse kasvukeskkonna asendumine anaeroobsega või vastupidi

5. Temperatuuri shokk

6. C-, N- või P-nälgimine

Kõik need muutused kutsuvad bakterirakus esile stressi. Hoolimata keskkonna muutustest peavad DNA replikatsioon, rakkude kasv ja jagunemine olema balansseeritud. Translatsiooniaparaadis osalevad vähemalt 150 erinevat geeniprodukti (rRNA-d ja ribosoomi valgud, tRNA-d, aminoatsüül-tRNA süntetaasid, translatsiooni initsiatsiooni, elongatsiooni ja terminatsiooni faktorid). Erinevaid bioloogilisi protsesse koordineeritakse globaalse regulatsiooni kaudu. Globaalsele regulatsioonile alluvad kõik operonid. Operonid, mida kontrollib üks regulaatorvalk, moodustavad reguloni. Samasse reguloni kuuluvate operonide induktsioon võib üsna ulatuslikult varieeruda. Näiteks temperatuurishoki reguloni (Htp) puhul täheldatakse osade HSP-de (heat shock proteins) puhul temperatuuri tõusu korral 5- kuni 7-kordset induktsiooni, mõnede HSP-de tase rakus tõuseb aga üle 70 korra. Stressivastuse käigus võidakse produtseeritakse rakus signaalmolekule e. alarmoone. Tuntumad signaalmolekulid on näiteks cAMP ja guanosiintetrafosfaat ppGpp.

Erinevaid regulone kontrollivad regulaatorid võivad transkriptsiooni kas stimuleerida (näiteks PhoB), inhibeerida (näiteks LexA) või mõnede geenide puhul stimuleerida ja teiste puhul inhibeerida (näiteks Lrp – leucine response protein). Osa regulone on kontrollitud RNA polümeraasi alternatiivsete sigma faktorite poolt (näiteks s³² e. RpoH regulon, kus transkriptsiooni stimuleerib temperatuuritõus). Regulatsioon võib toimuda mitmel erineval viisil:

1) regulaatori kovalentne modifitseerimine – enamasti fosforüleerimine/defosforüleerimine (PhoB, NtrI),

2) negatiivse regulaatori degradeerimine (näit. LexA),

3) sigma faktori rakulise hulga tõstmine (s³²),

4) valgu konformatsiooni muutmine ligandi sidumisel.

Bakteris E. coli on kirjeldatud ligikaudu 1000 erinevat operoni ning paarsada erinevat reguloni. Erinevatesse regulonidesse kuuluvad operonid või geenid võivad kuuluda modulonidesse. Samasse moduloni kuuluvaid geene/operone kontrollib lisaks nende erinevatele regulaatoritele ka ühine globaalne regulaator (näiteks cAMP retseptorvalk CRP e. CAP).

Globaalse regulatsiooni kirjeldamiseks on võetud kasutusele veel mõiste stimulon. Stimuloni kuuluvad geenid, operonid, regulonid ja modulonid, mille tööd mõjutab üks ja sama keskkonnastiimul. Samasse stimuloni kuuluvate regulatoorsete üksuste tööd kontrollivad erinevad regulaatorid. Näiteks P-nälja puhul aktiveerub PhoB regulon, mis kontrollib 38 geeni avaldumist, kuid P-nälja puhul on indutseeritud kokku 145 erinevat valku. Nälja korral lähevad rakud statsionaarsesse faasi ja neis indutseeritakse ka RpoH regulon, Lrp regulon, LexA-kontrollitud SOS regulon ja OxyR regulon. Lisaks paljude valkude induktsioonile põhjustab P-nälg 137 erineva valgu repressiooni.

Kuidas teha kindlaks, millised geenid ja nende poolt kodeeritud valgud kuuluvad mingisse kindlasse stimuloni? Selleks on kasutusel mitmeid meetodeid.

1. Globaalne translatsiooni uurimine

Rakkudest eraldatud valgud lahutatakse kahedimensionaalsel polüakrüülamiid geelelektroforeesil. Valgud märgistatakse kasvatamise käigus ³⁵S-ga. Iga valk liigub geelis vastavalt oma molekulmassile ja isoelektrilisele punktile kindlasse kohta, mis on pärast autoradiograafia tegemist tuvastatav musta plekina. Teades erinevate valkude lokalisatsiooni autoradiograafial, saame jälgida, milliste valkude süntees rakus erinevate stiimulite mõjul indutseeritakse või represseeritakse.

2. Globaalne transkriptsiooni uurimine

Rakkudest eraldatakse totaalne RNA ja mRNA-le sünteesitakse komplementaarne radioaktiivselt märgistatud cDNA. Märgistatud cDNA-ga hübridiseeritakse teadaolevaid kodeerivaid DNA järjestusi, mis on kantud kas nailonfiltrile või klaasile. Hübridisatsioonimustri põhjal on võimalik hinnata, milliseid geene rakus milliste stiimulite mõjul transkribeeritakse. Varem hübridiseeriti genoomse raamatukogu kloone. Kui bakteril on teada kogu genoomi järjestus, siis on võimalik PCR-i abil amplifitseerida kõik valku kodeeruvad järjestused ning hübridiseerida nendele radioktiivne cDNA. Nii on näiteks PCR-i abil amplifitseeritud kõik 4288 E. coli valku kodeerivat geeni ja uuritud, milliste geenide transkriptsioonitase muutub rakus vastusena temperatuurishokile (temperatuuri tõstmine 37°C-lt 50°C-ni) või milliseid erinevusi transkriptsioonitasemes on võimalik tuvastada bakterite kasvatamisel võrdlevalt minimaalsöötmel ja rikkal söötmel.

Laktoosi operoni regulatsioon E. coli rakkudes: induktsioon ja kataboliitne repressioon

Laktoosi operon (lac operon) sisaldab promootorit P, operaatorit O ja kolme struktuurgeeni lacZ, lacY ja lacA. Geen lacZ kodeerib b-galaktosidaasi, millel on kaks funktsiooni: ta lõikab laktoosi molekuli kaheks monosahhariidiks, glükoosiks ja galaktoosiks ning konverteerib laktoosi operoni induktoriks allolaktoosiks. b-galaktosiidi permeaas, mis on kodeeritud geeni lacY poolt, transpordib laktoosi rakku. Geeni lacA poolt kodeeritud transatsetülaasi bioloogilist funktsiooni rakus ei teata. Laktoosi operoni puhul esineb nii positiivne (transkriptsiooni aktiveerib CRP e. CAP valk) kui ka negatiivne regulatsioon (transkriptsiooni pärsib LacI repressor).

Induktsioon

Lac operon on indutseeritav, sest operonis asuvad struktuurgeenid avalduvad ainult laktoosi olemasolul. Tegelikult toimub lac operoni geeniproduktide süntees väga madalal tasemel ka ilma laktoosita, sest operoni induktor allolaktoos tekib b-galaktosidaasi toimel. Lac operoni regulaatorgeen lacI kodeerib 360 aminohappe pikkust repressorvalgu subühikut. Aktiivne lac repressor on tetrameerne valk, mis koosneb neljast identsest subühikust. Kui induktorit rakus ei ole, on ta seondunud operaatoriga ja operoni transkriptsioon on alla surutud. Allolaktoosi seondumine repressoriga põhjustab selle dissotseerumise operaatorilt.

Lac operoni regulatsioonimehhanismid selgitati geneetiliste meetoditega, kasutades laktoosi metabolismi suhtes erinevaid mutantseid tüvesid. Mutatsioonid lacI geenis ja operaatoralas võimaldasid lac operoni produktide konstitutiivset sünteesi. Indutseeritav fenotüüp taastus osaliste diploidide konstrueerimisel, kui mutantidesse viidi algne lacI geen. Funktsionaalne repressor, mille geen paiknes võrreldes mutantse repressori geeniga füüsiliselt teises kohas, oli sellest hoolimata võimeline transkriptsiooni pärssima, kuna repressori molekulid difundeerusid raku erinevatesse piirkondadesse. Sellist distantsi tagant toimet nimetatakse trans–toimeks.

LacI võib lac operoni reguleerida nii trans- kui ka cis-toimeliselt. lac operaator O on funktsionaalne ainult cis-toimelisena, kuna repressori seondumine operaatoralale peab füüsiliselt takistama struktuurgeenide transkriptsiooni.

Mutatsioonid lac operoni promootoralas ei muuda operoni indutseeritavust, vaid RNA polümeraasi võimet initsieerida transkriptsiooni lac promootorilt. lac promootoris on RNA polümeraasi seondumisala ning seondumissaidid aktivaatorvalgule CAP (catabolite activator protein), mida sageli nimetatakse ka CRP-ks (cyclic AMP retceptor protein). Kui bakterite kasvukeskkonnas on lisaks laktoosile ka glükoosi, on glükoosi kasutamine eelistatud ning lac operoni geenide transkriptsioon pole aktiveeritud.

Kataboliitne repressioon

Nähtust, kus glükoosi juuresolekul kasvukeskkonnas eelistatakse teistele substraatidele glükoosi, nimetatakse glükoosi efektiks e. kataboliitseks repressiooniks. Lac operoni ning ka mitmete teiste operonide kataboliitne repressioon on vahendatud aktivaatorvalgu CAP (CRP) ja tema efektormolekuli tsüklilise AMP (cAMP) poolt. Selleks, et toimuks transkriptsiooni initsiatsioon lac promootorilt, peab promootoralaga seonduma CAP-cAMP kompleks. Aktivaatorvalk seondub promootoralale dimeerina ning interakteerub otseselt RNA polümeraasi a-subühikuga, soodustades sel viisil RNA polümeraasi seondumist promootorile ning transkriptsiooni initsiatsiooni.

Rakusisene cAMP kontsentratsioon on tundlik glükoosi koguse suhtes. Kui rakus on kõrge glükoosi kontsentratsioon, langeb cAMP tase järsult. cAMP madala kontsentratsiooni tõttu pole aktivaator CAP võimeline seonduma lac operoni promootorile ning RNA polümeraas ei ole võimeline transkriptsiooni initsieerima. Glükoosi olemasolul rakkudes jääb lac operoni transkriptsiooni tase alla 2% tema aktiveeritud tasemest glükoosi puudumise korral. Kataboliitne repressioon toimib sama skeemi järgi ka arabinoosi (ara) ja galaktoosi (gal) operonide puhul.

Trüptofaani operoni regulatsioon E. coli rakkudes: repressioon ja attenuatsioon

Trüptofaani biosünteesi korismahappest kodeerivad viis geeni. Trüptofaani operoni trp avaldumine on reguleeritud transkriptsiooni initsiatsiooni repressooni ja transkriptsiooni enneaegse terminatsiooni kaudu.

Repressioon

Geen trpR, mis kodeerib trp operoni repressorit, paikneb operoni lähedal. Operaatorala O paikneb tugeva promootori P₁ regioonis. Lisaks P₁–le on operonil ka teine, nõrk promootor P₂. Geeni trpA järel paiknevad kaks transkriptsiooni terminaatorjärjestust t ja t’. Järjestus trpL kodeerib 162-nt pikkust mRNA liiderjärjestust.

Trüptofaani (korepressori) puudumisel seondub RNA polümeraas promootorregiooni ja algatab trp geenide transkriptsiooni. Trüptofaani olemasolul rakkudes seondub trüptofaan repressoriga ning trüptofaan-repressor kompleks seondub promootoralaga kattuvale operaatorile, takistades transkriptsiooni initsiatsiooni.

Võrreldes transkriptsioonitasemega trp promootorilt trüptofaani olemasolu korral, on operoni transkriptsioonitase sellelt promootorilt derepresseeritud olekus 70 korda kõrgem. TrpR mutantide korral on operoni ensüümide tase rakus trüptofaani juuresolekul rakus aga ikkagi 10 korda alla surutud. Põhjuseks on attenuatsioon, mis viib transkriptsiooni enneaegsele termineerumisele.

Attenuatsioon

Kui deleteerida trp operonist trpL regioon, tõuseb trp operoni ekspresioonitase. Samas säilub operoni represseeritavus trüptofaani poolt. trp operoni regulatsiooni järjestuse trpL vahendusel nimetatakse attenuatsiooniks ning järjestust trpL attenuaatoriks. Attenuatsioon kontrollib transkriptsiooni terminatsiooni mehhanismi operoni liiderjärjestustel. trp operoni transkriptsiooni terminatsioon liiderjärjestuselt toimub siis, kui tRNA^Trp on trüptofaani poolt laetud. Sel juhul sünteesib RNA polümeraas operonilt ainult 140 nt pikkuse RNA molekuli.

Attenuatsiooni piirkonnas asuvad DNA järjestused, mis sarnanevad transkriptsiooni terminatsiooni signaalidele bakterites. Need järjestused koosnevad G:C – rikkast palindroomsest alast, millele järgneb A:T – rikas ala. Sellele piirkonnale vastav mRNA moodustab juuksenõelastruktuuri, millega külgneb U – rikas järjestus. DNA ja RNA vahelised sidemed nõrgenevad ning RNA polümeraas dissotseerub DNA-lt. Prokarüootses rakus toimuvad transkriptsioon ja translatsioon samaaegselt – parasjagu sünteesitavalt mRNA-lt algab kohe translatsioon. trp operoni liiderjärjestus on võimeline moodustama alternatiivseid sekundaarstruktuure. Kui omavahel paarduvad nukleotiidid regioonidest 1 ja 2 ning 3 ja 4, moodustuvad sekundaarstruktuurid, mis termineerivad transkriptsiooni, kui aga omavahel paarduvad nukleotiidid regioonidest 2 ja 3, on terminatsiooni põhjustavate juuksenõelastruktuuride moodustumine takistatud ning transkriptsioon jätkub.

Trüptofaani operoni liiderjärjestuselt toimub ka translatsioon. Liiderpeptiidis on kaks trüptofaani. Kaks Trp koodonit paiknevad trpL järjestuses kõrvuti. Kui rakus pole trüptofaani, peatub valgusüntees sellel kohal ning omavahel paarduvad nukleotiidid regioonidest 2 ja 3. Kuna sel juhul ei teki transkriptsiooni terminatsiooni signaali, jätkub operoni transkriptsioon. Kui aga rakkudes on trüptofaani, järgneb translatsioon Trp koodonitelt ning ribosoom takistab regioonide 2 ja 3 omavahelist paardumist. Regioon 3 on nüüd vaba paarduma regiooniga 4 ning moodustub transkriptsiooni terminatsiooni struktuur. Trüptofaani olemasolu korral rakkudes termineerub trp operoni transkriptsioon enneaegselt ligikaudu 90% juhtudest. Seega võib trp operoni avaldumistase muutuda ligi 700 korda (10-kordne attenuatsiooniefekt + 70-kordne repressiooniefekt).

Regulatsiooni attenuatsiooni kaudu on kirjeldatud ka treoniini, isoleutsiini, leutsiini, fenüülalaniini ning histidiini biosünteesi operonide puhul.

Arabinoosi operoni regulatsioon E. coli rakkudes: positiivne ja negatiivne kontroll

lac operoni puhul toimub operoni geenide negatiivne kontroll läbi LacI seondumise operaatoralale ja positiivne kontroll läbi aktovaatorvalgu CAP seondumise lac promootoralale. Arabinoosi operoni (ara operoni) regulatsioon on komplekssem. Sama regulaatorvalk AraC toimib nii positiivse kui ka negatiivse regulaatorina. ara operoni transkriptsiooni kontrollivad mitmed cis- ja trans-toimelised elemendid. Näiteks üks cis-toimeline element, mis kontrollib promootori aktiivsust, asub promootorist 200 aluspaari kaugusel. ara operonis paikneb kolm struktuurgeeni araB, araA ja araD, mis kodeerivad arabinoosi katabolismis osalevaid ensüüme. Arabinoosi transpordi eest rakku vastutavad kolm geeni, mis paiknevad ara operonist eemal.

Operoni regulaatori AraC geeni transkriptsioon algab promootorilt P_C, mis paikneb 100 aluspaari eemal ara operoni struktuurgeenide promootorist P_BAD. Transkriptsioon nendelt promootoritelt on vastassuunaline. Nii nagu lac operon, on ka ara operon allutatud kataboliitsele repressioonile. Operoni positiivses regulatsioonis osalevad AraC ning CAP koos cAMP-ga. Need valgud seonduvad operoni transkriptsiooni aktivatsiooniks regiooni araI, mis paikneb struktuurgeenide ja AraC geeni vahel. Struktuurgeenide transkriptsiooni initsiatsiooni kohast 211 aluspaari eespool asub teine AraC seondumise koht araO₂. Lisaks on teada ka araO₁, mis kontrollib regulaatorgeeni transkriptsiooni promootorilt P_C.

Selleks, et toimuks ara operoni repressioon, seonduvad AraC dimeerid saitidesse araI ja araO₂. Seondunud dimeeride omavaheline interaktsioon põhjustab DNA lingu moodustumist AraC seondumiskohtade vahele ning takistab RNA polümeraasi seondumist promootorile P_BAD. ara operon on indutseeritud cAMP ja arabinoosi olemasolu korral rakus. Sel juhul käitub AraC transkriptsiooni aktivaatorina. Komplekside arabinoos-AraC ning cAMP-CAP seondumisel regiooni araI on lingu moodustumine takistatud.

Bakteriofaag lambda lüsogeenne ja lüütiline tsükkel

Vastavalt bakteriofaagide paljunemisstrateegiale jaotatakse nad virulentseteks ja mõõdukateks faagideks. Virulentsed faagid (näit. T4) põhjustavad alati pärast faagipartiklite taastootmist peremeesraku surma. Sellist elutsüklit nimetatakse lüütiliseks tsükliks. Mõõdukad faagid (näit. faag lambda) võivad aga pärast bakteriraku nakatamist valida kas lüütilise tsükli või lülituda bakteri kromosoomi, replitseeruda kromosoomi koostisosana ja püsida seal, ilma et faagi paljundamisega seotud geenid avalduksid, paljude rakupõlvkondade vältel. Sellist kromosoomi integreerunud faagi nimetatakse profaagiks ja tema paljunemisstrateegiat lüsogeenseks. Mingil hetkel profaag vabaneb ja paljuneb lüütilise tsükli teel.

Faag lambda on mõõdukas faag lüütilise tsükli ja lüsogeense staadiumiga. Genoomis on kaks erinevates suundades transkribeeritavat operoni ning nende vahele jääb immuunsust tagav operon.

Faag lambda adsorbeerub E. coli välismembraani retseptoritele. Need on kodeeritud malB geeni poolt (maltoosi transport rakku). Seetõttu kasvatatakse lambdaga nakatatavat bakterikultuuri maltoosi juuresolekul. Faagi adsorptsioon toimub efektiivselt nii toatemperatuuril kui ka 37° C juures mõne minuti jooksul. DNA sisenemine ja lüütilise tsükli geenide avaldumine saab toimuda aga ainult 37° C juures.

Faag lambda genoom on täielikult sekveneeritud, 48514 bp pikkune dsDNA molekul.

Lüsogeenne staadium

Viiruse DNA integreerub raku kromosoomi, kus ta püsib latentses olekus profaagina. Sel juhul toimub lüütiliste geenide inaktivatsioon lambda repressori cI kaudu.

Lüütiline paljunemistsükkel

Faag lambda geenid avalduvad kaskaadselt. Infektsiooni varajases faasis avalduvad geenid N ja Cro, mis kontrollivad järgmise faasi geenide tööd. Vähesel määral toimub ka replikatsioonil osalevate geenide transkriptsioon. N valk on antiterminaator, mis võimaldab jätkata operonis sisalduvate lüütiliste geenide transkriptsiooni. Cro valk on lambda repressori cI antagonist, s. t. pärsib cI geeni transkriptsiooni. Infektsiooni järgmises etapis avalduvad replikatsiooni ja rekombinatsiooni valgud ning Q valk. Q valk on samuti antiterminaator, ta võimaldab läbi viia hiliste geenide transkriptsiooni. Hiliste geenide avaldumise tagajärjel sünteesitakse rakus pea ja saba valgud, toimub viiruspartiklite assambleerimine ning seejärel rakud lüüsitakse. Raku kohta vabaneb 100 viiruspartiklit, kogu infektsioonitsükkel vältab 35 minutit.

Valik lüütilise tsükli ja lüsogeensuse vahel sõltub sellest, kumb valk, kas Cro või cI on rakus ülekaalus. Primaarse tähtsusega on cI taset positiivselt mõjutava valgu cII stabiilsus: proteaasid, mis degradeerivad cII, on aktiveeritud rakkude kasvamisel rikkal söötmel ja rakud lähevad eelistatult lüütilisse tsüklisse. Rakkude näljutamisel toimub valik lüsogeensuse kasuks. UV-kiirguse ja mõnede kemikaalide mõjul toimub profaagi vabanemine kromosoomist ja faagi paljunemine lüütilise tsükli kaudu. UV kiirgus põhjustab rakus SOS vastuse, mille tulemusena aktiveerub RecA valk. RecA valk inaktiveerib lambda repressori cI.

Lambda repressoril cI on amino-terminaalses osas (N-terminus) DNA-ga seondumise domeen ja karboksü-terminaalses osas (C-terminus) valgu dimerisatsiooni domeen. Repressor cI seondub dimeerina operaatoraladele O_L ja O_R, mis kattuvad vasaku ja parema operoni promootoraladega ning takistab sellega lüütiliste geenide transkriptsiooni. Mõlemas operaatoralas eristatakse kolme 17 aluspaari pikkust repressori seondumise saiti. cI afiinsus erinevatele saitidele on erinev – kõige efektiivsemalt seondub ta saitidesse O_L1 ja O_R1, mis kattuvad lüütiliste geenide promootoralaga. Seondumine saitidesse O_L1 ja O_R1 suurendab repressori afiinsust saitidele O_L2 ja O_R2. Repressori normaalse rakusisese kontsentratsiooni korral on need neli saiti täidetud ja transkriptsioon promootoritelt P_L ja P_R takistatud. cI seondumisel saiti O_R2 soodustab cI transkriptsiooni cI promootorilt P_RM, käitudes sel juhul enda aktivaatorina. Kui cI kontsentratsioon rakus tõuseb kõrgeks, seondub cI ka nõrgema afiinsusega saitidesse O_L3 ja O_R3. Sait O_R3 kattub promootoriga P_RM, mistõttu cI seondumisel sinna saiti on transkriptsioon tema enda geeni promootorilt represseeritud. Seega näeme cI puhul ka autoregulatsiooni, kus valk ise kontrollib oma sünteesi taset rakus.

Valk Cro, mis on lambda repressori cI antagonist, pärsib cI geeni transkriptsiooni, seondudes selle geeni promootoralale. Ta seondub samadesse saitidesse O_L ja O_R kui cI, kuid erineva afiinsusega. Eelistatud on saidid O_L3 ja O_R3. Teised saidid täituvad järjekorras sait 2 ja sait 1 siis, kui Cro valgu kogus rakus on tõusnud. Cro valgu seondumine saiti O_R1 supresseerib transkriptsiooni promootorilt P_R, vähendades sellega varajaste lüütiliste geenide produktide (antiterminaatorvalk N ja Cro valk) sünteesitaset rakus. Valiku lüütilise või lüsogeense tsükli kasuks otsustab see, kas operaatoralale seondub cI või Cro. Kui operaatoraladele seondub cI, läheb faag lambda lüsogeensesse tsüklisse. Selleks, et algaks üldse cI geeni transkriptsioon, on vaja promootorit P_RE (promoter for repressor establishment) ja kahte regulaatorvalku cII ja cIII. Valku cII on vaja transkriptsiooni aktivatsiooniks promootorilt P_RE ja cIII stabiliseerib valku cII sõltuvalt rakkude kasvutingimustest. Kehvade kasvutingimuste korral kaitseb cIII valku cII proteaaside eest efektiivsemalt, soodustades sel viisil valikut lüsogeense tsükli kasuks. Nii cII kui ka cIII geenid on hilinemisega varajased (delayed early) geenid, mis vajavad oma avaldumiseks antiterminaatorit N. Seega peab cI geeni transkriptsiooni initsiatsiooniks algul toimuma varajaste ja hilinemisega varajaste lüütiliste geenide avaldumine. cI geenilt sünteesitakse mRNA, mille mittekodeeriv 5’ ots on komplementaarne geeni cro mRNA-ga, mille süntees algab promootorilt P_R. See antisens-RNA hübridiseerub Cro valgu mRNA-ga, takistades Cro translatsiooni. Kui repressorit cI on juba sünteesitud, toimub selle seondumine operaatoraladele O_R1 ja O_R2 ning algab repressori geeni transkriptsioon promootorilt P_RM.

Geenide avaldumise ajaline lahutatus faagi infektsiooni korral

Virulentsete faagide geenid avalduvad ajalises järgnevuses. Vahetult pärast infektsiooni avalduvad varajased geenid. Ühe või mitme varajase geeni produkte on vaja järgmiste geenide avaldumiseks. Sõltuvalt faagist on selliseid geenide rühmi kaks kuni neli. Regulatsioon toimub põhiliselt transkriptsiooni tasemel. Kõige detailsemalt on ajalist regulatsiooni uuritud E. coli faagide T7 ja T4 puhul ning Bacillus subtilise faagi SP01 puhul. Varajaste geenide transkriptsiooni viib läbi bakteri RNA polümeraas. Ümberlülitused uute geenirühmade transkriptsiooniks toimuvad läbi bakteri RNA polümeraasi modifitseerimise (faagid T4 ja SP01) või faagi enda poolt kodeeritud RNA polümeraasi (faag T7) kasutamise tulemusena. Faagide poolt kodeeritud või modifitseeritud RNA polümeraasid tunnevad ära faagi-spetsiifilisi promootoreid ja initsieerivad sealt faagi geenide transkriptsiooni. Bakteri RNA polümeraasi modifitseerimine toimub faagi poolt kodeeritud valkude abil.

Geenide ekspressiooni kontroll translatsiooni tasemel

Kuigi põhiline geeniregulatsioon prokarüootses rakus toimub transkriptsiooni tasemel, lisandub sellele sageli regulatsioon translatsiooni tasemel. Sama operoni siseselt transkribeeritakse kõiki geene võrdselt, kuid sageli on raku elutegevuseks vaja sama operoni poolt kodeeritud erinevaid geeniprodukte erineval hulgal. Näiteks lac operoni puhul sünteesitakse laktoosi sisaldavatel minimaalsöötmetel kasvatatud rakkudes 3000 molekuli b-galaktosidaasi, 1500 molekuli b-galaktosiidi permeaasi ja 600 b-galaktosiidi transatsetülaasi raku kohta. Nende valkude süntees erinevas koguses saab olla kontrollitud ainult transkriptsioonijärgselt.

Bakterirakus toimuvad samaaegselt nii geeni transkriptsioon, translatsioon kui ka vastava mRNA degradatsioon. Seega võib sama operoni poolt kodeeritud geeniproduktide erinev hulk raku kohta olla tagatud kolme erineva mehhanismi poolt:

1. Translatsiooni initsiatsiooni efektiivsus võib erinevate geenide puhul olla erinev;

2. Ribosoomide liikumine mööda mRNA molekuli toimub erinevate geenide puhul erineva kiirusega. Sageli takistavad ribosoomide liikumist mRNA sekundaarstruktuurid;

3. Erinevate geenide mRNA degradatsiooni kiirus võib olla erinev.

Geenide avaldumise regulatsiooni translatsiooni tasemel on põhjalikult uuritud näiteks ribosomaalsete valkude puhul. Kui rakud kasvavad optimaalsetes tingimustes, toimub nende kiire kasv ning nad vajavad valgusünteesiks rohkem ribosoome kui rakud, mis kasvavad kehvades tingimustes. E. coli ribosoomid sisaldavad kolme erinevat rRNA molekuli ja 52 erinevat ribosoomi valku. Enamus ribosomaalsete valkude geene paiknevad operonides ja nende valkude süntees peab olema koordineeritud kolme erineva rRNA sünteesiga, sest ribosoomide assambleerimiseks vajatakse neid kõiki kindlas koguses. Ribosomaalse valgu S10 geenide klaster sisaldab näiteks 10 koordineeritult reguleeritavat geeni. Sellise regulatoorse üksuse puhul on üks geenidest iseenda ja teiste negatiivseks regulaatoriks. Geen rplD kodeerib ribosoomivalku L4. Kui rakus leidub vabu rRNA molekule, seondub L4 nendega ja assambleeritakse ribosoomi. Vaba rRNA puudumisel seondub L4 aga S10 operoni mRNA 5’ otsaga, takistades sellelt translatsiooni. Selline mehhanism väldib ribosoomivalkude asjatut sünteesi rRNA puudumisel. Negatiivne autoregulatsioon esineb ka teiste ribosomaalsete valkude operonide puhul.

Regulatsioon translatsioonijärgselt

Translatsioonijärgne regulatsioon toimub valkude aktiivsuse muutmise kaudu rakus. Näiteks, kui biosünteesiraja lõppprodukti on rakku kogunenud juba piisavalt, toimub sünteesiraja esimese ensüümi inhibitsioon. Sel viisil inhibeeritavad ensüümid sisaldavad lisaks substraadi seondumise saidile ka efektormolekuli seondumise kohta. Lõppprodukt seondub ensüümi efektormolekuli saiti ja inhibeerib sel teel ensüümi. Sellist inhibitsiooni mehhanismi nimetatakse tagasisidestuslikuks inhibitsiooniks (feedback inhibition) või lõpp-produkti poolseks inhibitsiooniks. Inhibitsiooni tulemusena muutub valgu konformatsioon. Selliseid allosteeriliste üleminekutega ensüüme nimetatakse allosteerilisteks ensüümideks. Allosteerilised üleminekud võivad põhjustada ka ensüümide aktivatsiooni. Mõni ensüüm võib olla osade efektormolekulide poolt inhibeeritav ja teiste poolt aktiveeritav. Näiteks glutamiini süntetaas, mis on multimeerne ensüüm, on aktiveeritav ja inhibeeritav 16 erineva metaboliidi poolt.

22. Eukarüootsete geenide regulatsioon. Vähitekke geneetilised alused.

Eukarüootsete geenide ruumiline ja ajaline regulatsioon.

Eukarüootsed organismid on enamasti multirakulised, koosnedes paljudest erinevatest rakutüüpidest. Multirakulise organismi väljaarenemiseks on vajalik, et teatud grupp geene avalduks täpselt õiges kohas õigel ajal. Seega on geeniregulatsiooni mehhanismid eukarüootsetes rakkudes võrreldes prokarüootsetega märksa komplitseeritumad.

Kuigi eukarüootsetes organismides on tuhandeid geene, ei avaldu nad korraga. Osa geene avalduvad ainult teatavat tüüpi kudedes – geenide ruumiline regulatsioon. Geenide avaldumine on reguleeritud ka ajaliselt. Osa geene avalduvad vastusena teatavatele bioloogilistele signaalmolekulidele, näiteks hormoonidele, osa aga vastusena väliskeskkonna stiimulitele. Kõige silmatorkavam on geenide ajastatud regulatsioon organismi arengu vältel viljastatud munarakust multirakulise organismini.

Tubuliini geenide ruumiline regulatsioon taimedel.

Tubuliini molekulid on rakus mikrotuubulite ehituskivideks. a ja b tubuliini molekulid agregeeruvad, moodustades dimeeri. Dimeeride assambleerumise tagajärjel moodustuvad õõnsad, silindrilised mikrotuubulid. Mikrotuubulite omavahelise ageregeerumise tulemusena moodustuvad komplekssemad struktuurid nagu ripsmed ja viburid. Tänu mikrotuubulitele toimub ka kromosoomide liikumine mitoosis. a ja b tubuliin on kodeeritud erinevate geenirühmade poolt. Umbrohuna kasvaval taimel Arabidopsis thaliana (harilik müürlook) on 6 a tubuliini geeni ja 9 b tubuliini geeni. Erinevad geenid ekspresseeruvad erinevates kudedes. Geen TUA1, mis kodeerib ühte a tubuliinidest, avaldub peamiselt tolmuterades, tema ekspressioonitase on madal või puudub üldse lehtedes, vartes või juurtes. Samas näiteks geen TUB1, mis kodeerib b tubuliini, avaldub ainult juuretippudes.

Loomade globiini geenide ajaline regulatsioon.

Hemoglobiin vastutab selgroogsete loomade vere hapniku transpordi eest. Kõrgematel selgroogsetel on hemoglobiini molekul tetrameer, mis koosneb kahest a- ja kahest b-globiini ahelast. Inimese a- ja b-globiini geenid paiknevad genoomi kahes erinevas regioonis: a-globiini geenid 16-ndas kromosoomis 28 kb pikkuses segmendis ning b-globiini geenid 11-ndas kromosoomis 45 kb pikkuses DNA lõigus. Need geenid on evolutsiooni käigus tekkinud algsete globiini geenide duplitseerumiste tulemusena ja moodustavad nüüd eraldi geenide perekonna. Erinevad geenid sisaldavad erinevaid mutatsioone ja nii on ka polüpeptiidides väikesed erinevused. Mõned geenid sisaldavad lugemisraami nihkeid või stop koodoneid, mistõttu nad ei kodeeri enam funktsionaalsete globiini molekulide sünteesi. Selliseid geene nimetatakse pseudogeenideks ja neid tähistatakse kreeka tähega psii (y). Geeniklastrites sisalduvad erinevaid globiinimolekule kodeeruvad geenid avalduvad organismi arengu erinevatel etappidel – mõned ainult embrüos, mõned lootes ning mõned vastsündinus, kuna neil arenguetappidel on organismi hapnikuvajadus erinev.

Eukarüootse geeniregulatsiooni moodused.

Nii eukarüootidel kui ka prokarüootidel toimub geenide avaldumise regulatsioon primaarselt transkriptsiooni tasemel ning seejärel valgu sünteesi kaudu. Erinevalt prokarüootidest toimub eukarüootidel enne translatsiooni RNA protsessimine: RNA 5’ otsa lisatakse “cap” struktuur ning 3’ ots polüadenüleeritakse. Samuti toimub mittekodeerivate intron-järjestuste kõrvaldamine. Eukarüootse raku jagunemine organellideks komplitseerib samuti geeniregulatsiooni. Transkriptsioon toimub tuumas ning seal toimub ka RNA modifitseerimine ning splaissing (intronite kõrvaldamine). Seejärel eksporditakse mRNA tsütoplasmasse, kus ta assotsieerub ribosoomidega, milledest paljud paiknevad endoplasmaatilisel retiikulumil ning toimub polüpeptiitide süntees.

Kontroll transkriptsiooni tasemel.

Prokarüootses rakus toimub transkriptsioon siis, kui negatiivne regulaator nagu näiteks lac repressor on geeni lähedusest kõrvaldatud ja positiivne regulaatormolekul nagu näiteks cAMP-st sõltuv aktivaatorvalk CAP (CRP) on seondunud geeni promootoralaga. Kuna prokarüootne rakk on keskkonnaga vahetus kontaktis ja seega otseses sõltuvuses väliskeskkonna muutustest, toimivad ümberlülitusmehhanismid raku metabolismis väga kiiresti.

Transkriptsiooni kontroll eukarüoodi rakus on komplekssem. Üheks põhjuseks on see, et geenid paiknevad tuumas. Selleks, et keskkonnasignaalid saaksid mõjutada transkriptsiooni, peavad nad esmalt jõudma raku pinnalt tsütoplasmasse ja sealt läbi tuuma membraani kromosoomideni. Seega vajavad eukarüootsed rakud transkriptsiooni regulatsiooniks sisemist signaalsüsteemi. Teine komplitseeriv faktor on eukarüootsete organismide multirakulisus. Signaalid peavad liikuma läbi paljude rakukihtide, enne kui nad jõuavad spetsiifilise koeni, kus konkreetsete geenide avaldumist kontrollitakse. Seega on eukarüootse transkriptsiooni seisukohalt väga oluline ka rakkudevaheline kommunikatsioon.

Nii nagu prokarüootides, toimub ka eukarüootides transkriptsiooni regulatsioon läbi valk-DNA interaktsioonide. Positiivsed ja negatiivsed regulaatorvalgud seonduvad DNA spetsiifiliste regioonidega ning stimuleerivad või inhibeerivad transkriptsiooni. Vastavaid valke nimetatakse transkriptsioonifaktoriteks.

RNA alternatiivne splaissing.

Enamus eukarüootseid gene sisaldavad mittekodeerivaid järjestusi – introneid. Selleks, et moodustuks transleeritav mRNA, toimub mittekodeerivate järjestuste väljalõikamine ja kodeerivate järjestuste – eksonite - täpne ühinemine. Protsessi nimetatakse splaissinguks ning see toimub splaissosoomides. Kui geenis sisaldub palju introneid, võidakse introneid RNA molekulist kõrvaldada kas eraldi või kombineeritult. Kui näiteks kaks kõrvuti paiknevat intronit eraldatakse korraga, võidakse kõrvaldada ka nendevaheline ekson. Nii moodustuvad erinevad mRNA molekulid, mis kodeerivad erinevaid polüpeptiide. Vastavat protsessi nimetatakse alternatiivseks splaissinguks.

Alternatiivne splaissing esineb näiteks troponiin T geeni avaldumise puhul. Troponiin T esineb selgroogsete skeletilihastes. Tegemist on väikese valguga, mille pikkus varieerub vahemikus 150 – 250 aminohapet. Rotil on troponiin T geen 16 kb pikkune, sisaldades 18 eksonit. RNA splaissingu produktid on erinevad. Kõik polüpeptiidid sisaldavad eksoneid 1 –3, 9 –15 ja 18, kuid eksonite 4 – 8 võivad mõnedel variantidel puududa. Ka eksonite 16 ja 17 olemasolu varieerub sõltuvalt sellest, milliste lihasrakkudega on tegemist.

Teine alternatiivse splaissingu näide puudutab äädikakärbse sugu määravate geenide avaldumist. Põhiline regulaator Drosophila soo määramisel on Sxl (Sex-lethal) geeni produkt. Geneetiliselt emaste järglaste puhul on RNA splaissitud nii, et sellelt transleeritakse regulaatorvalk. Geneetiliselt isaste puhul sisaldab mRNA eksonit stop koodoniga, mille tulemusena sünteesitakse ainult lühike polüpeptiid, millel puuduvad regulatoorsed funktsioonid. XX emastes, kus puudub Sxl regulaator, avalduvad geenid, mis võimaldavad embrüol areneda isaseks kärbseks. Kumb splaissingu variant realiseerub, sõltub X kromosoomide suhtest autosoomodesse. Kui X:A = 1,0, on splaissingu tulemuseks mRNA, mis kodeerib Sxl valku, kui aga X:A suhe on 0,5, toimub teistsugune splaissing, mille tulemusena mRNA regulaatorit ei kodeeri.

mRNA stabiilsuse tsütoplasmaatiline kontroll.

Valgusünteesiks transporitakse mRNA-d tuumast tsütoplasmassse. Translatsioon toimub konkreetselt mRNA molekulit seni, kuni see degradeeritakse. Seega on mRNA degradatsiooni kiirus geeni ekspressiooni seisukohalt samuti väga oluline. Pikaealised mRNA molekulid võimaldavad paljude polüpeptiidi molekulide sünteesi, lühiealised aga ainult väheste. mRNA kiiret degradatsiooni rakus kompenseerib geeni pidev transkriptsioon. Vastasel juhul konkreetset polüpeptiidi varsti enam ei sünteesitaks. Polüpeptiidi ajutine süntees võib olla regulatoorse tähtsusega. Näiteks organismi teataval arenguetapil võib teatavat polüpeptiidi ainult teataval hetkel vaja olla, tema pidev olemasolu võib aga hoopis kahjulikult mõjuda.

mRNA eluiga mõjutavad polü-A saba olemasolu (ilma polü-A-ta mRNA-d on väga lühiealised) ja 3’ mittetransleeritavad regioonid (UTR). Osadel lühiealistel mRNA molekulidel on järjestus AUUUA 3’ mittetransleeritavas alas paljudes kordustes. Kui selline kordus viia stabiilsele mRNA-le, muutub ka see ebastabiilseks.

Transkriptsiooni aktivatsiooni indutseerimine keskkonna ja bioloogiliste faktorite poolt.

Uurides E. coli laktoosi operoni regulatsiooni, leidsid Jakob ja Monod, et lac operoni geene transkribeeritakse siis, kui rakkude kasvukeskkonnas on laktoosi. Seega on laktoos vastavate geenide transkriptsiooni induktoriks. Võrreldes prokarüootsete regulatsiooni süsteemidega on eukarüootsete geenide puhul induktsiooni vähem kirjeldatud.

Temperatuur: temperatuurishoki geenid.

Kui organismi väliskeskkonna temperatuur tõuseb, sünteesitakse kiiresti terve rida valke, mis aitaksid raku sisemust stabiliseerida, vältida valkude degradeerumist. Temperatuurishoki mõjul sünteesitud valke nimetatakse “heat-shock” valkudeks (HSP). HSP-sid leidub nii prokarüootsetes kui ka eukarüootsetes organismides: E. coli ja Drosophila HSP-d on 40 – 50% ulatuses identsed.

HSP valkude regulatsioon on kontrollitud transkriptsiooni tasemel. Temperatuuri tõus indutseerib otseselt vastavate geenide transkriptsiooni. Drosophila HSP70 on 70 kD suurune valk, mis on kodeeritud kahe geenide perekonna poolt, mis paiknevad ühes autosoomidest. Kokku on neid geene 6 koopiat. Kui väliskeskkonna temperatuur tõuseb üle 33°C, nagu see võib juhtuda kuumadel suvepäevadel, aktiveeritakse HSP70 geenide transkriptsioon. Transkriptsiooni aktiveerib valk HSTF (Heat-Shock Transcription Factor), mis temperatuuri tõusu korral on alternatiivselt fosforüleeritud. DNA järjestusi, kuhu HSTF seondub, nimetatakse HSE-deks (heat-shock response elements).

Valgus: ribuloos 1,5-bifosfaadi karboksülaasi (RBC) geenid taimedes.

RBC-l on oluline roll taimede fotosünteesil. Selle ensüümi toimel viiakse süsihappegaas suhkru molekulideks, mille edasine metabolism võimaldab rakul toota energiat. Protsess sõltub taime võimalusest siduda valguseenergiat. RBC on spetsiifiliselt indutseeritud siis, kui taimedel on valgust. RBC on kompleksne valk, mis koosneb suurest ja väikesest subühikust. Osadel taimedel on mõlemaid subühikuid kodeerivad geenid tuuma DNA-s, osadel taimedel on aga suurema subühiku geen kloroplasti DNA poolt kodeeritud. Väikese subühiku geeni rbcS transkriptsioon on aktiveeritud siis, kui taimed on valgustatud. Valguse absorbtsioon toimub tsütoplasmaatilise valgu fütokroomi poolt. Iga fütokroomi molekuli küljes on valgust absorbeeriv molekul kromofoor. Valguse absorbeerimine kromofoori poolt kutsub esile konformatsioonilised muutused fütokroomi molekulis, mis on omakorda signaaliks muutustele järgmistes valkudes. Need valgud omakorda seonduvad rbcS geeni regulaatorpiirkonda ja stimuleerivad geeni transkriptsiooni.

Signaalmolekulid: geenide aktivatsioon vastuseks hormoonidele.

Üks rakutüüp eukarüootses organismis võib saata teistele signaale hormoonide sekretsiooni kaudu. Loomades on kaks põhilist hormoonide klassi – steroidhormoonid ja peptiidhormoonid. Steroidhormoonid on väikesed, rasvlahustuvad kolesterooli derivaadid. Tänu oma lipiidsele struktuurile pole neil raskusi rakumembraani läbimisel. Siia klassi kuuluvad näiteks östrogeen ja progesteroon (naissuguhormoonid), testosteroon (oluline meeste soolises diferentseerumises), glükokortikoidid (vajalikud vere suhkrusisalduse reguleerimiseks) ning ekdüsoon (kontrollib putukate arengut). Kohe pärast rakku sisenemist interakteeruvad steroidhormoonid tsütoplasmaatilise valguga, mida nimetatakse hormoonretseptoriks. Retseptori ja hormooni kompleks liigub seejärel tuuma, kus ta toimib transkriptsioonifaktorina.

Peptiidhormoonid koosnevad aminohapete lineaarsetest ahelatest, mis on geenide poolt kodeeritud. Siia kuuluvad näiteks insuliin (reguleerib vere suhkrutaset), somatotropiin (kasvuhormoon) ja prolaktiin (toimib emasorganismi piimanäärmetes). Peptiidhormoonid on liiga suured, et vabalt rakku pääseda ja annavad seetõttu oma signaali üle raku välispinnal asetsevatele membraanseoselistele retseptorvalkudele (membrane-bound receptor proteins). Nende struktuur muutub hormoonidega interakteerudes. Selle tagajärjel toimuvad muutused rakus olevates valkudes, mis kannavad signaali tsütoplasmast tuuma, muutes seal teatavate geenide aktiivsuse taset. Sellist signaali ülekannet nimetatakse signaalseks transduktsiooniks.

Hormoonide poolt indutseeritud geenide ekspressioon toimub spetsiifiliste DNA järjestuste HRE (hormone response elements) vahendusel. HRE-de arv reguleeritavate geenide ees võib varieeruda. Kui seal on mitu elementi, on efekt tugevam.

Geenide transkriptsiooni võivad indutseerida ka mittehormonaalsed molekulid, näiteks närvikasvufaktorid.

Eukarüootsete geenide transkriptsiooni molekulaarne kontroll.

DNA järjestused, mis osalevad transkriptsiooni kontrollis – võimendajad (enhancers) ja vaigistajad (silencers).

Transkriptsiooni initsiatsioon toimub geeni promootorregioonilt, mille tunneb ära RNA polümeraas. Selleks, et RNA polümeraas seonduks promootoralale, on vajalik basaalsete transkriptsioonifaktorite olemasolu. Eukarüootsete geenide transkriptsiooni kontrollivad ka paljud spetsiaalsed transkriptsioonifaktorid. Need faktorid seonduvad regulatoorsetele DNA järjestustele – transkriptsiooni võimendajatele (stimuleerivad transkriptsiooni) ja vaigistajatele (pärsivad transkriptsiooni). Rohkem on leitud transkriptsiooni võimendajaid

Transkriptsiooni võimendajaid iseloomustavad järgmised omadused:

1) nad võivad toimida kauge vahemaa tagant, isegi mitme kb kaugusel reguleeritavast geenist;

2) nende mõju geenide avaldumisele ei sõltu nende orientatsioonist;

3) nende toime ei sõltu asukohast – nad võivad paikneda geenist eespool, tagapool või intronites.

Nende omaduste poolest erinevad transkriptsiooni võimendajad promootoritest, mis üldiselt paiknevad aktiveeritavate geenide ees ja on kindla orientatsiooniga.

Transkriptsiooni võimendajad võivad olla üsna pikad, kuni mitusada aluspaari. Mõnikord sisaldavad nad kordusjärjestusi, millel on regulatoorne tähtsus nende elementide endi seisukohalt. Enamus võimendajaid toimivad koespetsiifiliselt. Koespetsiifilisuse näiteks võib tuua Drosophila geeni yellow. See geen vastutab paljude kehapiirkondade pigmentatsiooni eest. Metsiktüüpi kärbestel on keha erinevatel osadel (tiivad, jalad rinnak, tagakeha) ühesugune pruunikasmust pigmentatsioon, mutantsetel aga kollakaspruun. Osadel mutantidel on pigmentatsioon mosaiikne mutatsioonide tõttu, mis võimaldavad geenil yellow avalduda ainult teatavates kudedes. Mosaiiksus oli põhjustatud mutatsioonidest geeni transkriptsiooni reguleerivates transkriptsiooni võimendajates. Mutatatsiooni sisaldav järjestus ei toiminud teatavates kudedes enam võimendajana.

Üks esimesi transkriptsiooni võimendajaid kirjeldati ahvi viiruse SV40 puhul. SV40 genoom on 5,2 kb suurune ning sisaldab ühte 220 bp pikkust võimendajat. Ta reguleerib kahe geenide grupi transkriptsiooni. Võimendajast paremale jäävad geenid, mida transkribeeritakse SV40 infektsiooni varajases staadiumis, vasakule jäävad “hilised geenid”. Võimendav element sisaldab kahte 72 bp pikkust kordusjärjestust, mis mõlemad võivad tagada võimendava efekti ka eraldivõetuna. Elemendi positiivne mõju transkriptsioonile säilub hoolimata tema orientatsioonist ja asukohast geenide suhtes. SV40 genoomi elektronmikroskoopilised vaatlused näitasid, et võimendajat sisaldav piirkond oli nukleosoomidest vaba. Tõenäoliselt takistavad nukleosoomi moodustumist võimendajale seondunud transkriptsioonifaktorid.

Võimendajale ja promootorregiooni seondunud transkriptsioonifaktorid satuvad füüsilisse kontakti DNA lingude moodustumise tulemusena. Nende kokkusattumise tulemusena muutub transkriptsioonikompleks aktiivseks.

Valgud, mis osalevad transkriptsiooni kontrollis – transkriptsioonifaktorid.

Praeguseks on identifitseeritud palju eukarüootseid valke, transkriptsioonifaktoreid, mis stimuleerivad transkriptsiooni. Enamus neist valkudest sisaldab vähemalt kahte olulist domeeni – DNA-ga seonduvat domeeni ja transkriptsiooni aktivatsiooni domeeni. Need domeenid võivad paikneda molekuli erinevates osades, kuid võivad ka kattuda. Näiteks transkriptsioonifaktoril GALA4, mis kontrollib galaktoosi metabolismi pärmidel, paikneb DNA-ga seonduv domeen polüpeptiidi amino-terminuses (N-terminuses), üks transaktivatsiooni domeenidest molekuli keskel ning teine karboksü-terminuses (C-terminuses). Kattuvad domeenid on näiteks steroidhormooni retseptorvalgul. Sel valgul on ka kolmas oluline domeen, mis seob hormooni.

Transkriptsiooni aktivatsioon toimub läbi valkudevaheliste füüsiliste interaktsioonide, millega kaasnevad valkude konformatsioonilised muutused. Paljudele transkriptsioonifaktoritele on iseloomulikud teatavad struktuuresd motiivid:

1) “Tsink-sõrmed” (zink fingers) – lühikesed lingud, mis moodustuvad siis, kui kaks tsüsteiini ühest polüpeptiidi osast ja kaks histidiini teisest osast seovad koos tsingi iooni. Sellised struktuurid on olulised valgu DNA-ga seondumisel.

2) “Heeliks-pööre-heeliks” (helix-turn-helix) motiiv – kolm lühikest aminohapete heeliksit on üksteise suhtes pööratud. Sellise motiivi geneetiline ja biokeemiline analüüs näitas, et C-terminaalsem kolmest heeliksist vastutab DNA-ga seondumise eest, ülejäänud kaks aga valgu dimeriseerumise eest. Paljudel transkriptsioonifaktoritel on see ligi 60-st aminohappest koosnev motiiv kõrgelt konserveerunud ja seda nimetatakse homeodomeeniks, kuna motiiv esineb Drosophila homeootilistel (homeotic) geenidel. Mutatsioonid homeootilistes geenides mõjutavad oluliselt kärbse arengut. Näiteks mutatsioon geenis Antennopedia põhjustab väärarengu, kus tundlate asemel arenevad hoopis jalad.

3) “Leutsiini lukud” (leucine zippers) – rida aminohappeid leutsiiniga igas seitsmendas positsioonis ühest polüpeptiidist dimeriseerub teise polüpeptiidiga samasuguse motiivi kaudu. Polüpeptiidide interaktsioon toimub leutsiinide kaudu. Tavaliselt paiknevad need motiivid positiivselt laetud aminohapete kõrval, mis dimeriseerumise järel pääsevad esile ja seonduvad negatiivselt laetud DNA-ga.

4) “Heeliks-ling-heeliks” (helix-loop-helix) motiiv – kaks helikaalset aminohapete regiooni on teineteisest eraldatud mittehelikaalse linguga. Helikaalsed regioonid võimaldavad dimeriseerumist teise polüpeptiidi samasuguse regiooniga. Mõnikord külgnevad need motiivid positiivselt laetud aminohapetega ja sel juhul soodustab dimeriseerumine dimeeri seondumist DNA-le.

Kahe ühesuguse polüpeptiidi dimeriseerumisel moodustuvad homodimeerid, kahe erineva vahel heterodimeerid.

Geenide avaldumine kajastub kromosoomi ehituses.

Selleks, et toimuks transkriptsioon, peab DNA olema kättesaadav RNA polümeraasile ja transkriptsioonifaktoritele. DNA liiga tugev seondumine histoonidega ja teiste struktuursete valkudega võib transkriptsiooni pärssida. Geeni kontekst on samuti oluline, sest uues kohas võivad geeni transkriptsioonilist aktiivsust mõjutada teised regulatoorsed elemendid. Samuti võib erineda kromosoomi kondenstasiooniaste.

Transkriptsioon lambiharja-kromosoomide lingudel.

Metafaasi kromosoomides on DNA kondensatsiooniaste väga kõrge ning ainult väga vähestelt geenidelt toimub transkriptsioon. Transkriptsiooni toimumiseks peab kromatiin olema avatud. Esimesed kinnitused sellele leiti, kui analüüsiti tsütoloogiliselt amfiibide ootsüütide meioosikromosoomide transkriptsiooni. Need kromosoomid on väga pikad – 400 – 800 mm pikkused. Duplitseerunud kromosoome nimetatakse nende välimuse pärast lambiharja-kromosoomideks – neil on tugevalt kondenseerunud telg, millest ulatuvad välja lateraalsed lingud. Lateraalsed lingud lambiharja-kromosoomides kajastavad neis regioonides toimuvat aktiivset transkriptsiooni.

Transkriptsioon polüteenkromosoomide puhevil alades.

Polüteenkromosoomid on iseloomulikud näiteks äädikakärbsele ning koosnevad sadadest üksteisega külgnevatest tütarkromatiididest, mis moodustavad pika ning paksu kaablitaolise struktuuri. Polüteenkromosoomidel vahetuvad tumedad ja heledad vöödid. Juba pikka aega on arvatud, et vöötidel on kindel funktsioon. Seda põhjusel, et vastsete erinevatel arenguetappidel muutuvad teatavad vöödid difuusseteks, puhevil aladeks. In situ (kohapealne) hübridisatsioon näitas, et need piirkonnad vastavad aktiivselt transkribeeritavatele geenidele (konkreetse geeni suhtes valmistatud komplementaarne radioaktiivselt märgistatud DNA või RNA proov seondus transkribeeritavale alale). Arengu järgmisel etapil ühed puhevil alad kaovad ja tekivad uued. Ajaline puhevil alade ilmumine on kontrollitud steroidhormooni ekdüsooni poolt. Uued puhevil alad ilmuvad ka näiteks temperatuuri shoki korral ning vastavad HSP geenide asukohale.

Transkriptsiooniliselt aktiivse DNA molekulaarne organisatsioon.

Transkribeeritav DNA on pakitud nukleosoomidesse ning sisaldab nukleosoome sama tihedusega nagu ka mittetranskribeeritav DNA. Erinevus on aga kõrgemat järku struktuurides. Ka katsed DNA-d degradeerivate ensüümidega (näiteks DNaas I) näitavad, et transkribeeritav DNA on valkudele paremini kättesaadav. Näiteks b-globiini geeni transkribeeritakse kanade vererakkudes aktiivselt, ovalbumiini geeni aga mitte. M. Groudine ja W. Weintraub ekstrahheerisid vererakkudest kromatiini ning inkubeerisid seda DNaas I juuresolekul. Reaktsioonisegu analüüsist geenispetsiifiliste radioaktiivsete proovidega ilmnes, et b-globiini geeni DNA-st oli degradeeritud 50%, ovalbumiini geeni DNA-st aga ainult 10%. Edasised uuringud näitasid, et transkriptsiooniliselt aktiivsete geenide tundlikkus nukleaasidest sõltus kahe väikese mittehistoonse valgu HMG14 ja HMG17 olemasolust kromatiinis. Kui need valgud olid aktiivsest kromatiinist kõrvaldatud, kadus DNA tundlikkus nukleaasile, kui aga lisatud, taastus algne tundlikkus.

Kui eraldatud kromatiini töödelda väga madala DNaas I kontsentratsiooniga, lõikub DNA katki vähestest spetsiifilistest saitidest, mida nimetatakse DNaas I hüpersensitiivseteks saitideks. Sageli paiknevad need geenide ees promootorregioonis ning võiksid seega kajastada lokaalselt lahtikeerdunud DNA-d transkriptsiooni alguskohas.

Uurides polüteenkromosoome, leiti Drosophila HSP70 valgu geenide ees ja taga spetsiaalse kromatiini struktuuriga lühikesed DNA elemendid scs ja scs´ (specialized chromatin structures), mis olid suhteliselt hästi kaitstud DNaas I nukleaasse aktiivsuse eest, kuid külgnesid hüpersensitiivsete saitidega. scs ja scs´ elemendid eraldavad HSP70 geenid ümbritsevast kromatiinist, muutes need geenid sõltumatuks positsioonist kromosoomis. Nende elementide vahel oleva geeni viimisel erinevatesse kromosoomi piirkondadesse geeni ekspressioonitasemes muutusi ei esine, kui aga ükski neist elementidest puudub, muutub geeni avaldumistase sõltuvalt geeni asukohast kromosoomis.

Eukromatiin ja heterokromatiin.

Enamuse liikide puhul ei õnnestu interfaasirakkudes kromosoome identifitseerida. Kasutades Feulgen’i reagenti saab aga tuumas nähtavale tuua tugevamini ja nõrgemini värvuvad alad. Tugevamini värvuvat materjali nimetatakse heterokromatiiniks ning nõrgemini värvuvat eukromatiiniks. Geneetiliste ja molekulaarsete meetodite kombineerimisel leiti, et enamus geene paiknevad eukromatiinis. Kui mõni eukromatiinist pärinev geen viia kunstlikult heterokromatiini-rikkasse piirkonda, avaldub ta seal tunduvalt nõrgemini või üldsegi mitte. Samas on aga näiteks äädikakärbsel leitud heterokromatiinis geene, mis ekspresseeruvad. Nii paiknevad äädikakärbse X ja Y kromosoomi tsentromeeride läheduses olevas heterokromatiinis paljud ribosomaalset RNA-d kodeerivad geenid.

Geenide vaigistamine.

Eukarüootses rakus on antud ajamomendil paljud geenid vaikivas olekus. Transkriptsiooni pärsib spetsiifiliste valkude seondumine DNA-ga. Näiteks äädikakärbsel on leitud PcG valgud, mis pärsivad mõnede kärbse arengut kontrollivate transkriptsioonifaktorite geenide avaldumist areneva organismi teatud rakkudes ja kudedes. Mutantsete PcG valkude puhul ilmnevad kärbse fenotüübis silmatorkavad anomaaliad - näiteks tundlad arenevad jalakujulisteks.

DNA metülatsioon ja imprinting.

Imetajate genoomis on keskmiselt 40% G:C paare ja neist 2-7%-l on C metüleeritud. Enamasti on C metüleeritud 1-2 kb-pikkustes CpG saarekestes (CG dinukleotiididest rikkad alad), kus DNA on G:C-rikkam (60%). C võib olla metüleeritud. CpG saarekestes asuvaid dinukleotiide esitatakse struktuurina

5' mCpG 3'

3´ GpCm 5',

kus m näitab C metülatsiooni ja p fosfodiestersidet C ja G vahel DNA ahelas.

C metülatsiooni on võimalik testida restriktaasidega, mis ei lõika metüleeritud DNA-d. Näiteks restriktaas HpaII tunneb ära ja lõikab järjestust CCGG. Kui teine C sellest järjestusest on aga metüleeritud, HpaII DNA-d sellest kohast ei lõika.

Inimese genoomis on leitud 45 000 CpG saarekest. Enamus neist asuvad transkriptsiooni alguspunktide läheduses ning on harva kui üldse metüleeritud. Sellised CpG saarekestega külgnevad alad on hüpersensitiivsed DNaas I töötluse suhtes. Võrreldes muude genoomi piirkondadega on erinevusi nukleosoomi ehituses - seal on vähem histooni H1 ning osa histoone on atsetüleeritud. Histoonide atsetüleerimine soodustab transkriptsiooni aktivatsiooni.

Kui DNA on metüleeritud, viib see transkriptsiooni repressioonile. CpG metülatsioon indutseerib histoonide H3 ja H4 deatsetüleerimist. Seda soodustab metüülrühmaga seonduv valk MeCP2, mis moodustab multiproteiinse repressorkompleksi. Repressorkompleks muudab kromatiini struktuuri. Kompleksi kuuluvad ka näiteks deatsetülaasid HDAC1 ja HDAC2. DNA metülatsioonist tingitud geenide repressioon on stabiilne ning seda muudab ainult kas DNA demetülatsioon või tugev transkriptsiooni aktivaator, mis suudab DNA-ga seonduda hoolimata selle metülatsioonist. Kõige ulatuslikumalt on geenide transkriptsioon DNA metülatsiooni kaudu pärsitud imetajate X kromosoomi inaktivatsiooni puhul.

Imetajate DNA metülatsiooniga on seotud nähtus, kus teatavate geenide avaldumine on kontrollitud selle kaudi, kummalt vanemalt geen on päritud. Sellist geeni "mälu" oma päritolu kohta nimetatakse imprintinguks. Näiteks hiirel on kasvufaktorit kodeeriv geen Igf2. Arenevas emrüos avaldub ainult isalt päritud geen, emalt päritud geen on transkriptsiooniliselt inaktiivne geenile eelnevate CpG dinukleotiidide metülatsiooni tõttu.

Geenide amplifikatsioon.

Geenide avaldumist soodustab nende koopiaarvu tõus rakus – geenide amplifikatsioon. Kõige silmatorkavam geenide amplifikatsioon toimub amfiibide ootsüütides ribosomaalsete RNA geenide (rRNA geenide) puhul. Kolm põhilist rRNA tüüpi eukarüootidel on 5S rRNA, 18S rRNA ja 28S rRNA. Xenopus laevis’e genoomis on tuhandeid 5S rRNA geene (24000), kuid 18S ja 28S rRNA geene on alla tuhande diploidse raku kohta. Aktiivne rRNA süntees väga oluline ootsüütides, sest selleks, et pärast munaraku viljastamist saaks toimuda embrüo varajane areng, vajatakse seal palju ribosoome. Iga ootsüüt sisaldab 10¹² ribosoomi. Seetõttu peab ka kõiki rRNA molekule olema sünteesitud raku kohta vähemalt sama palju. Kuna 18S ja 28S rRNA geene on võrreldes 5S rRNA geenidega oluliselt vähem, toimub ootsüütides nende amplifikatsioon. Selle tulemusena moodustuvad väikesed ekstrakromosomaalsed rõngad, mis replitseeruvad veereva ratta mudeli järgi ning koosnevad ainult 18S ja 28S rRNA geenidest.

Imetajatel on kirjeldatud dihüdrofolaadi reduktaasi (DHFR) geeni amplifitseerumist. See geen amplifitseerub, kui rakud satuvad kontakti kematoterapeutilise ravimiga methotreksaat (methotrexate), mis inaktiveerib DHFR-i. Vastav geen amplifitseeritakse kas tandeemselt või ekstrakromosomaalsete koopiatena. Tandeemse replikatsiooni tulemusena pikeneb kromosoom nähtavalt ning see piirkond värvub mitoosis ühtlaselt. Ka ekstrakromosomaalsed koopiad on tsütoloogiliselt jälgitavad. DHFR geeni amplifikatsioon viib vastava ensüümi üleproduktsioonile rakkudes. Need molekulid, mis on ülehulgas ravimi molekulide suhtes, kutsuvad esile kogu raku DNA replikatsiooni ja rakkude jagunemise. Seega võib selle ravimi kasutamine vähi vastu anda hoopis vastupidise tulemuse.

Kromosoomide aktivatsioon ja inaktivatsioon.

XX/XY ning XX/XO sugu määravate süsteemide puhul on probleemiks, kuidas võrdsustada X-liiteliste geenide ekspressioonitaset mõlemast soost organismides. Imetajatel on see probleem lahendatud nii, et emasorganismis on võrdse tõenäosusega inaktiveeritud kas isalt või emalt päritud X kromosoom. Seega on mõlemal sugupoolel transkriptsiooniliselt aktiivne üks X kromosoomidest. Äädikakärbsel on emastel mõlemad X kromosoomid aktiivsed, kuid isastel on X-liitelite geenide transkriptsioonitase kahekordistunud. Sel juhul on tegemist hüperaktivatsiooniga. Nematoodil Caenorhabiditis elegans on XX isendid hermafrodiitsed, XO isendid aga isased. X-liiteliste geenide transkiptsioonitase mõlemast soost isendites võrdsustatakse osalise geenide represseerimisega hermafrodiitides. Sellist mehhanismi nimetatakse hüpoaktivatsiooniks.

X kromosoomide inaktivatsioon imetajatel.

X kromosoomi inaktivatsioon algab kindlast kohast, mida nimetatakse X inaktivatsiooni keskuseks XIC (X inactivation center) ning levib seejärel mõlemas suunas. Geen XIST (X inactive specific transcript), mis paikneb XIC regioonis, jääb transkriptsiooniliselt aktiivseks. Geenilt XIST sünteesitakse 17 kb pikkune RNA, mis ei kodeeri ühtegi polüpeptiidi. RNA molekulid on assotsieerunud inaktiivse X kromosoomiga, takistades sealt transkriptsiooni. Aktiivses X kromosoomis on geeni XIST transkriptsioon pärsitud.

Inaktiivsed X kromosoomid on kergesti identifitseeritavad. Interfaasis on nad kondenseerunud tugevalt värvuvaks massiks - Barri kehakeseks, mis on assotsieerunud tuumamembraaniga. Barri kehake on näide fakultatiivsest heterokromatiinist, sest see ei ole jälgitav kogu rakutsükli vältel. Seevastu konstitutiivne heterokromatiin, mis asub kromosoomide tsentromeeride piirkonnas, on jälgitav kogu rakutsükli vältel. S faasis Barri kehake dekondenseerub ning inaktiveerunud X kromosoom replitseerub mõnevõrra hiljem kui teised kromosoomid, sest tema kromatiini struktuur on erinev. Leiti, et aktiivsete kromosoomide puhul on histoon H4 keemiliselt modifitseeritud – polüpeptiidahelas olevatele lüsiinidele on lisatud atsetüülgrupid. Inaktiivse X kromosoomi puhul on modifitseeritud H4 leitud ainult kolmes kitsas regioonis, kus on transkriptsiooniliselt aktiivsed geenid. Modifitseeritud H4 ei leidu ka ülejäänud kromosoomide konstitutiivse heterokromatiini piirkonnas. Seega aitab modifitseeritud H4 säilitada geenide transkripsioonilist aktiivsust kromosoomis.

Naistel, kellel puudub üks X kromosoomidest, esineb Turneri sündroom. Enamus 45, X genotüübiga embrüoid hukkub. Turneri sündroomiga sünnib lapsi sagedusega 1:3000. Sellise kromosoomianomaaliaga indiviididel ilmneb kasvupeetus, viljatus, kerged anatoomilised kõrvalekalded. Kui tervetel naistel on erinevates rakkudes juhuslikult inaktiveeritud kas isalt või emalt pärti X kromosoom, on siiski üksikuid geene, mis peavad olema aktiivsed mõlemas X kromosoomis. Praeguseks on selliseid geene teada ligikaudu 20, mõned neist kodeerivad transkriptsioonifaktoreid. Osadel geenidel on leitud homoloog Y kromosoomis, mis tagab nende geenide võrdse ekspressiooni taseme mõlemal sool.

X kromosoomide hüperaktivatsioon äädikakärbsel.

Drosophila’l on X-liiteliste geenide doosikompensatsiooniks vaja vähemalt nelja erineva geeni produkti. Mutatsioon suvalises neist neljast geenist on isastele letaalne. Seetõttu hakati neid geene tähistama msl (male-specific lethal) lookusena. Üks msl geenide poolt kodeeritud valkudest sarnaneb oma järjestuselt RNA ja DNA helikaasidele. Arvatakse, et msl geenide poolt kodeeritud valgud muudavad histoonide atsetüleerimise kaudu kromatiini struktuuri.

X kromosoomide hüpoaktivatsioon nematoodis C. elegans.

X-liiteliste geenide osalise inaktivatsiooni mehhanismid hermafrodiitides pole täpselt teada, kuid identifitseeritud on geeni dpy-27 produkt, mis seondub spetsiifiliselt X kromosoomiga ainult siis, kui X kromosoomi on rakus kaks koopiat. Arvatavasti moodustub spetsiifiline valkkompleks, mis represseerib X-liiteliste geenide transkriptsiooni.

Vähi geneetilised alused.

Vähi puhul toimub rakkude kasv ja jagunemine kontrollimatult. Rakud jagunevad, kuhjudes üksteise otsa ning moodustavad tuumori. Kui rakkude kontrollimatu jagunemine kandub ka ümbritsevatesse kudedesse, nimetatakse tuumorit pahaloomuliseks (ingl. k. malignant). Pahaloomuline kasvaja levib teistesse kehapiirkondadesse, moodustades seal sekundaarseid tuumoreid. Protsessi nimetatakse metastaasiks. Kui tuumori rakud ei levi ümbritsevatesse kudedesse, on tegemist healoomulise (ingl. k. benign) kasvajaga. Mõlemal juhul põhjustavad rakkude kontrollimatut jagunemist muutused geenide avaldumises.

Vähirakke on võimalik in vitro tingimustes sageli lõpmatult paljundada. Vähirakke on võimalik saada ka normaalsete rakkude kultuurist, kui neid rakke töödelda kartsinogeenidega (teatud viirusted, kiirgus või mutageensed kemikaalid. Kui normaalsed rakud moodustavad söötmel ühe rakukihi, siis vähirakkudeks transformeerunud rakud kasvavad üksteise otsa, moodustades kuhilaid. Vähirakkude kas ja jagunemine ei allu teistelt rakkudelt saadetud signaalidele.

Rakutsükli regulatsioon.

Rakutsükli moodustab jada sündmusi, mille käigus toimub perioodiline DNA replikatsioon ning replitseerunud DNA jaotumine tütarrakkudesse. Eukarüootse raku rakutsüklis eristatakse nelja faasi – G₁, S, G₂ ja M. Kahte G faasi nimetatakse vahefaasideks (“gaps”), S faasis toimub DNA süntees ning M faasi ajal raku jagunemine. Imetajarakkude puhul, mida on kasvatatud koekultuuris, kestab rakutsükkel umbes 24 tundi. G₁ faas kestab 10 tundi ning sel ajal toimub rakus normaalne metabolism, rakk kasvab suuremaks, tema sisalduvate organellide arv kahekordistub ja toimub ettevalmistus DNA replikatsiooniks. S faas algab DNA replikatsiooniga ning kestab ligikaudu 9 tundi. S faasi lõpuks koosnevad kromosoomid kahest tütarkromatiidist. Kui replikatsioon on lõppenud, läheb rakk faasi G₂, mis kestab neli tundi. Selles faasis jätkub raku kasvamine ja ta valmistub mitoosiks. Mitoos (M faas) e. raku jagunemine kestab ligikaudu tunni. Selle käigus liiguvad tütarkromatiidid jaguneva raku vastaspoolustele. Teineteisest eraldunud tütarrakud on geneetiliselt identsed.

Rakutsükli toimumine on eukarüootidel väga täpselt kontrollitud protsess. Üleminek ühest tsükli faasist teise toimub rakuväliste ja rakusiseste keemiliste signaalide koostoimel. Rakutsüklis eristatakse mitmeid kontrollpunkte (checking points). Sisenemine igasse järgmisesse faasi vajab kindlaid signaale. Neid signaale võtavad vastu valgud, mida nimetatakse tsükliinideks ning valgud, mis komplekseeruvad tsükliinidega – tsükliinidest sõltuvad kinaasid CDK (cyclin-dependent-kinases). CDK valgud fosforüleerivad teisi valke, reguleerides sel teel nende valkude aktiivsust ja funktsioone. Üks kõige tähtsamaid rakutsükli kontrollpunkte START paikneb G₁ faasi keskel. See kontrollpunkt on reguleeritud D tüüpi tsükliinide ja CDK4 poolt. Kui kontrollpunktis toimub vajalike signaalide rakule edastatamine tsükliin-CDK kompleksi poolt, valmistub rakk minema S faasi. Raku sisenemist S faasi võivad takistada veel hilises G₁ faasis saadud negatiivsed signaalid nagu DNA kahjustused või toitainete vähesus. Neid signaale annavad edasi inhibiitorvalgud, pärssides tsükliin-CDK kompleksi toimimist rakus.

Vähirakkude puhul on sageli leitud, et tsükliin-CDK kompleksid on kaotanud reguleeritavuse mutatsioonide tõttu geenides, mis kodeerivad tsükliine või CDK valke. Kui näiteks kontrollpunkt START ei ole õigesti reguleeritav, muutub rakkude kasv ja jagunemine kontrollimatuks. Mitmete tuumorite puhul on kirjeldatud just selle kontrollpunkti regulatsiooni häireid. Normaalse rakutsükli regulatsiooni korral rakutsükkel DNA kahjustuste korral peatub, kuni DNA reparatsioonisüsteem need kahjustused kõrvaldab või kui kahjustusi ei suudeta parandada, siis läheb rakk apoptoosi ja sureb. Kui kontrollpunkt ei reageeri õigesti, võib DNA replikatsioon toimuda ka siis, kui DNA-s on kahjustusi. Selle tulemusena suureneb rakus mutatsioonide hulk, millest osa võivad põhjustada vähki.

Vähk on seotud geenidega.

Vähiteke on seotud muutustega geneetilises materjalis. Tõendid vähi geneetilistele alustele on järgmised:

1) Vähirakkude fenotüüp ilmneb ka tütarrakkudel;

2) Vähiteket võivad indutseerida teatud viirused;

3) Vähki indutseerivad kartsinogeenid põhjustavad DNA-s mutatsioone;

4) Mõnedes suguvõsades on vähk päritav;

5) Teatud verevähi vormid (leukeemia, lümfooma) on seotud kindlate kromosoomide aberratsioonidega.

Vähki põhjustavad mutantsed geenid jaotuvad kahte klassi:

1) Onkogeenid - geenid, mille mutantsed alleelid stimuleerivad rakkude jagunemist;

2) Tuumori supressorgeenid - mutantsete geenide puhul ei suudeta pärssida rakujagunemist.

Tuumorit indutseerivad retroviirused ja viiruslikud onkogeenid.

Paljude viiruste genoomiks on RNA molekul, millelt sünteesitakse pärast selle rakku sattumist komplementaarne DNA molekul. Seejärel inserteerub DNA kuhugi kromosoomi. Ensüüm, mis sünteesib RNA-lt DNA, on viiruse poolt kodeeritud. Seda ensüümi nimetatakse pöördtranskriptaasiks (revertaasiks) ning viiruseid retroviirusteks.

Esimene tuumoreid indutseeriv viirus kirjeldati kanadel 1910-ndal aastal Peyton Rous’i poolt ning seda hakati nimetama Rous’i sarkoomi viiruseks. Hiljem leiti, et tegemist on retroviirusega, mis sisaldab nelja geeni: gag – viiruspartikli (viriooni) kapsiidi valk; pol – pöördtranskriptaas; env – viiruse ümbrise valk ning v-src – proteiini kinaas, mis seondub viirusega nakatunud rakkude plasmamembraaniga. Proteiini kinaas fosforüleerib teatavaid raku valke, indutseerides sellega tuumori teket. Seetõttu nimetatakse geeni v-src onkogeeniks (vähki tekitavaks).

Tuumoreid indutseerivate retroviiruste puhul on kirjeldatud üle 20 erineva viiruse onkogeeeni, mida tavaliselt tähistatakse v-onc. Osa neist onkogeenidest on suguluses kasvufaktoreid kodeerivate rakuliste geenidega. Näiteks ahvi sarkoomi viirus sisaldab geeni v-sis, mis kodeerib kasvufaktorile PDGF (vajatakse haava kinnikasvamisel) sarnanevat valku. Mõned viirused kodeerivad kasvufaktorite retseptorite analooge. Paljud viiruslikud onkogeenid (v-ras onkogeenid) kodeerivad türosiini kinaase, mis jäävad raku sisemembraanile ning fosforüleerivad rakulisi valke. Leitud on ka onkogeene, mis kodeerivad transkriptsioonifaktoreid (v-jun, v-fos, v-myc).

Rakulised homoloogid viiruslikele onkogeenidele – protoonkogeenid.

Viiruslike onkogeenide poolt kodeeritud valgud on väga sarnased rakulistele regulatoorsetele valkudele. Mitmed rakulised geenid on leitud tänu nende sarnasusele viiruslikele onkogeenidele. Sel viisil leiti kanadel v-src geeni analoog, mis erinevalt viiruslikust geenist sisaldas 11 intronit. Viiruslike onkogeenide rakulisi homolooge nimetatakse proto-onkogeenideks või normaalseteks rakulisteks onkogeenideks (c-onc). Rakuline homoloog geenile v-src on seega c-src. Kodeerivad järjestused on mõlemal geenil sarnased, erinedes teineteisest ainult 18 nt poolest. c-onc geene on leitud paljudest erinevatest organismidest ja nad on küllaltki konserveerunud. Näiteks Drosophila’l on leitud selgroogsete onkogeenide homolooge ( c-ras, c-myb jt. ).

Miks ei sisalda viiruslikud onkogeenid introneid? Arvatakse, et nad pärinevad rakulistest c-onc geenidest. c-onc geenilt transkribeeritud ja protsessitud RNA on lisandunud retroviiruse genoomi.

Miks v-onc geenid indutseerivad tuumoreid, c-onc geenid aga mitte? Üks võimalik seletus seisneb selle, et viiruslike geenide ekspressioonitase on võrreldes rakuliste homoloogidega oluliselt kõrgem. Näiteks v-src puhul produtseeritakse raku kohta ligi 100 korda enam türosiini kinaasi kui seda rakulise c-src puhul. Viiruslikud onkogeenid võivad avalduda rakutsükli valel etapil. Samuti võib viirusliku onkogeeni produkt olla rakulise homoloogi mutantne versioon ning seetõttu uute omadustega.

Mutantsed rakulised onkogeenid.

c-onc geenide poolt kodeeritud valkudel on rakusiseste protsesside regulatsioonis võtmeroll. Mutatsioonid nendes geenides viivad vähi tekkele. Paljude vähivormide puhul on leitud spontaanseid mutatsioone rakulistes onkogeenides. Esimene selline tõend saadi Robert Weinbergi töögrupi poolt. Nad eraldasid DNA põievähi koest ning transfekteerisid sellega rakukultuuri. Transfekteeriv DNA oli eelnevalt geneetiliselt markeeritud. Vähirakkudeks transformeerunud rakke oli võimalik teistest eristada, kuna nad moodustasid agarplaatidel klompe. Nii identifitseeriti vähki indutseeriv DNA fragment, mis sisaldas c-H-ras alleeli. See alleel oli roti sarkoomiviiruse geeni homoloog. c-H-ras alleel sisaldas mutatsiooni algse geeni 12-ndas koodonis. Mutatsiooni tulemusena asendus polüpeptiidis glütsiin valiiniga, muutes valgu võimet hüdrolüüsida GTP-d. Normaalse valgu puhul sõltub Ras valgu aktiivsus sellest, kas see on seotud GTP või GDP-ga. Ekstratsellulaarsed signaalid nagu kasvufaktorid stimuleerivad inaktiivse Ras valgu konverteerumist aktiivseks. Selle käigus toimub viiakse GDP GTP-ks.

Aktiivne valk on seotud GTP-ga, defosforüleerimise tulemusena valk inaktiveerub, jäädes seotuks GDP-ga. Aktiivne valk kannab signaali tuuma, mille tulemusena toimub raku jagunemisel osalevate geenide transkriptsioon ning rakk jaguneb. Mutantne Ras valk on alati aktiivses vormis ja stimuleerib seetõttu rakkude kontrollimatut jagunemist. Mutantset c-ras geeni on hiljem kirjeldatud ka kopsu, soole, piimanäärmete vähi puhul, aga samuti ka neuroblastoomide (närvirakkude vähk), fibrosarkoomide (sidekoe vähk) ning teratokartsinoomide (sisaldavad erinevaid embrüoraku tüüpe) puhul. Kõigil juhtudel oli Ras valk mutatsiooni tulemusena pöördumatult aktiivses vormis ning sellepärast nimetatakse vastavaid mutatsioone dominantseteks aktivaatoriteks.

Mutatsioonid c-ras geenis ning teisi rakulisi onkogeene kodeerivates geenides võivad tekkida suvalises keharakus. Ainult ühest mutatsioonist tuumori tekkeks üldjuhul siiski ei piisa. Rakkudes on mitmeid varumehhanisme, mis leevendavad ühe mutatsiooni mõju. Kui aga ajajooksul tekib mutatsioone ka teistes rakkude kasvu reguleerivates geenides, muutub rakkude jagunemine kontrollimatuks. Samas on paljude tuumorite puhul vähemalt üks mutatsioonidest tekkinud c-onc geeni.

Ümberkorraldused kromosoomides.

Krooniline müelogeenne leukeemia (CML – chronic myelogeneous leukemia) on seotud inimese 22. kromosoomi aberratsiooniga. Kuna vastav aberratsioon kirjeldati esmalt Philadelphias, nimetatakse seda kromosoomi Philadelphia kromosoomiks. Philadelphia kromosoomi puhul on toimunud 9-nda ja 22. kromosoomi vahel retsiprookne translokatsioon, mille tulemusena 9-nda kromosoomi pika õla ots on ühinenud 22. kromosoomi keskmise osaga. 22. kromosoomi ots on aga liitunud 9-nda kromosoomiga. Translokatsiooni murdekoht 9-ndas kromosoomis asub onkogeenis c-abl ning kromosoomis 22 geenis bcr, mis kodeerib türosiini kinaasi. Translokatsiooni tulemusena need geenid liituvad. Liitgeen kodeerib hübriidset valku, mis indutseerib vähi teket.

Ka Burkitt’i lümfoomi puhul on tegemist retsiprookse translokatsiooniga, mis võib toimuda 8-nda kromosoomi ning kromosoomide 2, 14 või 22 vahel. Kõige tavalisem on translokatsioon 8-nda ja 14-nda kromosoomi vahel. Sel juhul satub c-myc onkogeen 8-ndast kromosoomist immunoglobuliini raske ahela geenide lähedusse ning tema ekspressioonitase tõuseb märgatavalt.

Tuumori supressorgeenid.

Geenide c-myc ja c-ras normaalsed alleelid kodeerivad valke, mis reguleerivad rakutsüklit. Kui need valgud on üleekspresseeritud või pidevalt aktiivses vormis, põhjustab see rakkude kontrollimatut jagunemist. Osa vähitüüpe areneb aga välja siis, kui teatav geen ei avaldu enam. See on põhjuseks näiteks retinoblastoomi (silma võrkkesta vähk) puhul. Geen RB, mis paikneb 13-nda kromosoomi pikas õlas, on retinoblastoomi rakkudes ühest homoloogist deleteerunud ning teises somaatilise mutatsiooni tagajärjel inaktiveerunud. Ka geeni RB produkt pRB valk on rakutsükli regulaator. Tema puudumine viib tuumorite moodustumisele. Seetõttu nimetatakse vastavat geeni tuumori supressorgeeniks.

pRB kontrollib rakutsükli geenide transkriptsioonifaktori E2F aktiivsust. pRB ja E2F kompleksis on E2F inaktiivne. Normaalse rakutsükli puhul, kui kontrollpunkti on jõudnud positiivsed signaalid selle kohta, et rakk võiks jaguneda, seonduvad tsükliinid tsükliinidest sõltuvate proteiinikinaasidega ning seejärel Rb fosforüleeritakse. Selle tulemusena E2F-pRB kompleks dissotseerub ning E2F aktiveerib nende geenide transkriptsiooni, mis on vajalikud raku jagunemiseks. Juhul, kui pRB valk on defektne, kaob rakutsükli regulatsioon: E2F on pidevalt aktiivne ning selle tulemusena jagunevad rakud kontrollimatult.

Üle 50% inimese vähijuhtudest on leitud mutatsioone tuumori supressorgeenis, mis kodeerib transkriptsiooni aktivaatorit p53. p53-l on tsentraalne roll mitmetes rakulistes protsessides:

1) Kui rakk puutub kokku väliskeskkonna faktoritega, mis kahjustavad DNA-d, võivad DNA ahelates tekkida kaksikahelalised katked, mis indutseerivad p53 sünteesi. Rakus käivituvad kaitsemehhanismid, kus DNA reparatsiooniensüümid püüavad DNA kahjustusi parandada, et vähendada organismile kahjulike mutatsioonide (ka nende, mis põhjustavad vähki) kuhjumist. p53 on transkriptsiooni aktivaatoriks DNA reparatsiooni ensüüme kodeerivatele geenidele.

2) DNA kahjustuste korral blokeeritakse rakutsükkel. p53 aktiveerib geenid, mille avaldumise korral rakutsükkel peatub ning represseerib geenid, mis on vajalikud raku jagunemisel. Kui rakutsükkel peatub, jääb aega mutatsioonide kõrvaldamiseks ning need ei fikseeru ega kandu edasi tütarrakkudesse.

3) Kui rakus on tekkinud pöördumatud kahjustused, aktiveerib p53 geenid, mis viivad raku programmeeritud surmani, apoptoosi. See on kõige äärmuslikum kaitsemehhanism, kus organism kõrvaldab vähipotentsiaaliga rakud.

Kui p53 on defektne, need 3 kaitsemehhanismi ei käivitu. Rakk hakkab kontrollimatult jagunema, DNA kahjustusi ei kõrvaldata, mutatsioonid kanduvad tütarrakkudesse, lisandub veel uusi mutatsioone, mis omakorda soodustavad tuumori arengut.

p53 roll rakutsükli peatamises.

p53 toimib transkriptsioonifaktorina, indutseerides p21 sünteesi. See valk omakorda inhibeerib CDK-de fosforüleeriva aktiivsuse. Sellest tulenevalt ei fosforüleerita pRB valku ning pRB inhibeerib E2F transkriptsioonifaktorid, mis on vajalikud raku jagunemisel osalevate geenide transkriptsiooni aktivatsioonil.

p53 roll apoptoosis.

p53 toimib transkriptsioonifaktorina, indutseerides BAX valgu sünteesi. BAX valk on antagonistlik valgule BCL-2, mis represseerib apoptoosi raja. BCL-2 repressori puudumisel lähevad rakud apoptoosi.

Organismi arengu jooksul on samuti osa rakke programmeeritud surema. Näiteks jäsemete arengul peavad sõrmede ja varvaste moodustumisel nende vahel asuvad rakud surema. Vastasel juhul kasvavad sõrmed ja varbad kokku. Embrüogeneesis esinev apoptoos on p53-st sõltumatu. Näiteks hiire TP53 mutant areneb normaalselt, kuid sünnijärgselt hakkavad tal tekkima tuumorid.

Kas vähk on päritav haigus?

Päritavate vähivormide puhul on enamasti tegemist mutatsioonidega kas tuumori supressorgeenides või DNA reparatsiooniensüüme kodeerivates geenides. Knudson on püstitanud kahe tabamuse hüpoteesi (two-hit hypothesis), mille põhjal selleks, et areneks vähk, peaksid defektsed olema mõlemad tuumori supressorgeeni alleelid. Päritavate vähihaiguste puhul on laps vanematelt saanud enamasti ühe mutantse alleeli. Rakupopulatsioonis tekib varem või hiljem spontaanne mutatsioon ka geeni teise alleeli ning sellest rakust, milles on mutatsiooni tagajärjel geeni mõlemad alleelid defektsed, arenebki tuumor.

Eelpoolkirjeldatud retinoblastoom on samuti päritav, sest kui indiviid kannab juba ühte deletsiooniga kromosoomi, on tõenäosus, et ka teine alleel homoloogilises kromosoomis somaatiliste mutatsioonide tagajärjel inaktiveerub, märksa suurem. See vähitüüp areneb ainult siis, kui mõlemad RB geenid on inaktiivsed.

Mõnede vähitüüpide korral, näiteks jämesoole vähi puhul, on mutatsiooni tagajärjel inaktiveerunud DNA reparatsioonil (DNA "mismatch" reparatsioon) osaleva valgu geen hMSH2. Selle valgu bakteriaalne homoloog on MutS. DNA reparatsiooni-defektsetes tüvedes tõuseb mutatsioonide tekkesagedus mitmeid suurusjärke ning seetõttu suureneb tõenäosus, et osa mutatsioone viivad raku kontrollimatu jagunemiseni. DNA "mismatch" reparatsiooni defektsuse korral tõuseb mutatsioonide osakaal eelistatult di- ja trinukleotiidsetes kordusjärjestustes.

Inimesel on leitud ka teisi tuumori supressorgeene: näiteks geen BRCA1 17-ndas kromosoomis surub maha rinna- ja munasarjavähi tekke. Tõenäosus, et naisel tema eluea vältel areneb välja rinnavähk, on üks kaheksale. Naised, kes on heterosügootsed mutatsiooni suhtes BRCA1 geenis, haigestuvad aga 85%-lise tõenäosusega. Hiljem leiti ka teine tuumori supressorgeen BRCA2. Mõlemad geenid kodeerivad transkriptsioonifaktoreid. Vastavatel valkudel pBRCA1 ja pBRCA2 on ka domäänid, mis võimaldavad neil interakteeruda teiste valkudega, näiteks valguga pRAD51, mis on eukarüootne homoloog bakteriaalsele RecA valgule ja osaleb DNA kahjustuste kõrvaldamisel. Geene BRCA1 ja BRCA2 inaktiveerivaid mutatsioone on palju ja erinevaid.

Valk pAPC reguleerib soolestiku epiteelrakkude uuenemist, seondudes b-kateniiniga, takistades sel viisil b-kateniinil aktiveerimast transkriptsioonifaktoreid, mis kutsuvad esile raku jagunemist. Kui pAPC on b-kateniiniga seondumise suhtes defektne, soolestiku epiteelkihis healoomulised adenoomid, millest mõned võivad hiljem (tavaliselt peale 40-ndat eluaastat) areneda tuumoriks.

Enamus vähitüüpe ilmnevad populatsioonis sporaadiliselt, ilma selgete päritavusseosteta. Ka 60% retinoblastoomidest ning 95% rinnavähkidest ei ole seotud päritavusega. Tavaliselt on vähiteke astmeline protsess, mille käigus akumuleeruvad somaatilised mutatsioonid geenidesse, mis kontrollivad raku jagunemist. Näiteks soolevähi puhul on selle kujunemiseks vaja vähemalt 7 sõltumatut mutatsiooni (esmalt tekib mutatsioon teises APC geeni alleelis, siis mutatsioonid K-ras proto-onkogeeni alleelides, 18-nda kromosoomi tuumori supressorgeenide alleelides ja TP53 alleelides.

Mutatsioon ühes geenis võib viia rakkude kiiremale jagunemisele, nii et moodustub healoomuline kasvaja. Mutatsioonid järgmistesse geenidesse võivad viia tuumori suuremaks arenemisele ning metastaaside tekkele. Osa sellistest mutatsioonidest on spetsiifilised teatud vähitüüpidele, mõned aga, näiteks mutatsioonid p53 kodeerivas geenis TP53, on leitud peaaegu kõigi tuumorite puhul.

23. Loomade arengu geneetiline kontroll.

Arenguprotsess loomadel.

Looma areng algab vahetult pärast munaraku viljastamist. Mõned arengu varajaseks järguks vajalikud valgud on eelnevalt juba munarakus sünteesitud. Pärast viljastumist toimub kiiresti mitu mitootilist jagunemist ning moodustub blastula. Juba blastulastaadiumis on osa rakke saanud ülesande olla tulevikus aluseks teatavate kudede moodustumisel. Arengu jätkudes blastula reorganiseerub, toimub rakkude migreerumine kolme kihti – protsessi nimetatakse gastrulatsiooniks. Embrüol on eristatavad ektoderm – välimine rakukiht; mesoderm – vahelmine rakukiht ning endoderm – sisemine rakukiht. Need kolm kihti saavad aluseks kudedele, mille baasil tulevikus moodustuvad organid. Rakud eristuvad üksteisest ning vastavat protsessi nimetatakse diferentseerumiseks.

Oogenees ja viljastumine.

Organismi arengu varajast etappi mõjutab munaraku tsütoplasmas sisalduv materjal. Munarakk sisaldab ka toitaineid embrüo kasvuks. Munaraku moodustumisel jagunevad rakud ebavõrdselt. Esimesel meiootilisel jagunemisel tekib üks suur rakk, sekundaarne ootsüüt ja väike rakk, polaarkeha. Ka teine jagunemine on ebavõrdne – jällegi moodustub polaarkeha, mis degenereerub ning suurem osa tsütoplasmast jääb munarakule. Ka munarakku ümbritsevad rakud toidavad munarakku. Munarakk viljastub, kui tema kesta läbib seemnerakk.

Lõigustumine ning blastula moodustumine.

Viljastatud munarakk e. sügoot jaguneb kaheks rakuks, mis jagunevad omakorda, kuni embrüo koosneb paljudest rakkudest. Sellist algset jagunemist nimetatakse lõigustumiseks (cleavage division). Mõnel juhul võib see toimuda asümeetriliselt ning siis saavad tütarrakud erineval hulgal tsütoplasmat, kuigi geneetiliselt on kõik rakud võrdsed. Edasisel diferentseerumisel avalduvad erinevates rakkudes erinevad geenid. Erinevateks rakutüüpideks diferentseerumisele eelneb determinatsioon – protsess, mille käigus määratakse erinevate rakkude tulevane arengusuund. Seda on kontrollitud kirurgiliselt, muutes blastulas rakkude asukohta.

Gastrulatsioon ja morfogenees.

Gastrulatsiooni tulemusena moodustuvad kolm primitiivset kudet – ektoderm, mesoderm ja endoterm, millest hiljem diferentsieeruvad spetsiifilised koed nagu närvikude, lihaskude, luukude, vererakud jne. Rakkude kombineeritud liikumine ja diferentseerumine viib organite moodustumisele ja areneva organismi keha omandab kindla kuju. Seda protsessi nimetatakse morfogeneesiks.

Mudelorganismide arengu geneetiline analüüs.

Kaasaegne arengubioloogia baseerub geneetilisel analüüsil, mis algab organismi arengu seisukohalt oluliste geenide identifitseerimisega. Tavaliselt on see seotud selliste mutatsioonide uurimisega, mis annavad kirjeldatava fenotüübi, näiteks tiibade puudumise putukatel. Kui vastavad mutatsioonid on testitud alleelsuse suhtes ja kaardistatud, uuritakse, millised mutatsioonid on teiste suhtes epistaatilised. Geenide funktsioonide molekulaarsete mehhanismide väljaselgitamiseks nad isoleeritakse, kloneeritakse ning uuritakse, milliseid valke nad kodeerivad. Põhiosas on arengubioloogid kontsentreerunud vähestele mudelorganismidele nagu Drosophila melanogaster ja Caenorhabditis elegans. Viimasel ajal tehakse palju katseid ka hiirtega.

Mudelorganism Drosophila melanogaster.

Drosophila munarakk on ellipsoidne, 1 mm pikkkune. Iga munarakk on ümbritsetud spetsiaalse kihiga – koorioniga. Esimeses otsas on kaks filamenti, mis aitavad raku sisemusse tuua hapnikku. Seemnerakk siseneb läbi teise esiosas paikneva struktuuri, mida nimetatakse mikropüüliks. Vahetult peale viljastamist on sügoodi jagunemine nii kiire, et tütarrakkude vahele ei jõua membraani moodustuda ja tekib sünsüütsium. Pärast 9-ndat jagunemist sisaldab sünsüütsium 512 tuuma, mis seejärel liiguvad embrüo äärealadesse ja jagunevad veel neli korda. Osa rakke liigub veel spetsiaalselt embrüo tagumisele poolusele. Pärast 13-ndat jagunemist eralduvad rakud tsütoplasmaatiliste membraanidega ning tekib rakuline blastoderm, kus on üle 4000 raku. Blastodermi tagumisele poolele liikunud tuumadest moodustuvad pooluse rakud, mis on aluseks sugurakkudele. Seega toimub somaatiliste ja sugurakkude liinide eristumine juba väga varakult, blastula staadiumis.

Umbes päevaga areneb äädikakärbse embrüost vastne. Vastne kasvab väga kiiresti, vahetab 2 korda kesta ning moodustab viie päeva pärast nuku. Nukustaadiumis (neli päeva) hävivad paljud vastsespetsiifilised koed ning moodustuvad täiskasvanud kärbsele iseloomulikud organid nagu tundlad, silmad, tiivad ja jalad. Kuna täiskasvanud isendit nimetatakse valmikuks, imaagoks (ingl. k. imago), nimetatakse vastse erinevates osades paiknevaid rakukogumikke, millest arenevad organid, immaginaaldiskideks (imaginal discs).

Mudelorganism Caenorhabditis elegans.

Täiskasvanud C. elegans on 1 mm pikkune. Ta paljuneb kiiresti ja on suure järglaskonnaga. Teda on kerge kultiveerida agarsöötmetel, kuhu on toiduks külvatud E. coli rakke. Optimaalsetes tingimustes kestab elutsükkel kolm päeva.

C. elegans on hermafrodiitne ning kergesti iseviljastuv. Seetõttu saab temalt kergesti homosügootseid järglasi. Tal on kaks X kromosoomi ja 5 autosoomi. Mõnikord võivad meioosi käigus X kromosoomide mittelahknemise tulemusena moodustuda X kromosoomita rakud ning sel juhul arenevad pärast munaraku viljastumist XO isased.

C. elegans on läbipaistev, mistõttu kõiki tema rakke on kerge vaadelda. Iga täiskasvanud hermafrodiit sisaldab 959 somaatilist tuuma (mõned rakud on mitmetuumalised) ja määramatu arvu sugurakke. Peale viljastumist lõigustub sügoot asümeetriliselt mitu korda, mille käigus produtseeritaks kuus “rajajat” (founder) rakku. Üks neist annab aluse sugurakkude liinile, teine soolestikule ning kolmas keha seina lihastele. Ülejäänud kolmest rakust arenevad põhiliselt närvi- ja lihasrakud. Neid rakuliine nimetatakse invariantseteks.

Arenguteede geneetiline analüüs.

Biokeemiliste metabolismiradade puhul võib mutatsioon ühes konkreetses geenis blokeerida kogu raja, sest sel juhul ei tööta üks rada edasiviivatest ensüümidest. Samal põhimõttel viiakse läbi ka arengubioloogilisi uuringuid. Arengutee koosneb erinevatest üksteisele järgnevatest sündmustest. Iga sündmus on kudede ja organite diferentseerumise seisukohalt oluline. Erinevate sündmuste toimumisel osalevad erinevate geenide produktid - signaalmolekulid, signaalide retseptorid ning signaalide edasikandjad ja regulaatorvalgud. Tüüpiline rada näeb välja järgmine:

Geen A ® Geen R ® Geen C ® Geen T ® Geen X

� � � � �

sekreteeritud membraan- tsütoplasmaatiline transkriptsiooni- valk X

signaal seoseline valk faktor diferentsee-

valk A retseptor- runud

valk rakus

Kõige detailsemalt on arenguradasid uuritud äädikakärbse ja C. elegans’i sootunnuste kujunemisel. Need rajad kontrollivad somaatiliste kudede diferentseerumist isas- ja emasorganismidele iseloomulikuks. Drosophila puhul on määrav roll geeniproduktidel, mis reguleerivad RNA splaissingut, C. elegans’il aga transkriptsioonifaktoritel, signaalmolekulidel ja nende retseptoritel. Põhiline, mis määrab soo mõlema organismi puhul, on X kromosoomide suhe autosoomidesse.

Soomääramine äädikakärbsel.

Soomääramise süsteem, mis põhineb X:A suhtel, hõlmab eelnevalt munarakku sünteesitud valkude interaktsiooni X-liiteliste geenide poolt kodeeritud valkudega. XX embrüode puhul on X-liitelisi valke võrreldes XY embrüodega kaks korda enam. Kuna nende geenide arv mõjutab suhtes X:A loendaja (numerator) väärtust, nimetatakse vastavaid geene numeraatorelementideks. Autosoomis lokaliseeruvate geenide hulk mõjutab nimetaja (denominator) väärtust ja seetõttu kutsutakse neid geene denominaatorelementideks. Denominaatorelemendid kodeerivad valke, mis on antagonistlikud numeraatorelementide poolt kodeeritutele. Kui denominaatorelementide doos kasvab, numeraatorelementide doos väheneb ja organism ei arene emaseks. Näiteks genotüübi XX AAA puhul on järglaste sootunnused vahepealsed (intersex).

Kui X:A suhe on kindlaks tehtud, aktiveerib vastav signaal XX emastes geeni Sxl transkriptsiooni, seejärel sünteesitakse valk SXL. Hilisemas arengujärgus toimub geeni Sxl transkriptsioon ka XY embrüodes, kuid sel juhul teiselt promootorilt ning transkripti splaissing toimub teisiti, nii et sellelt transleeritakse ainult lühike polüpeptiid ilma regulatoorsete funktsioonideta. Funktsionaalse regulaatorvalgu SXL mRNA sisaldab kõiki eksoneid välja arvatud kolmas, mis sisaldab stop koodonit. XY embrüodes säilub pärast splaissingut ka kolmas ekson, mistõttu polüpeptiidi süntees katkeb kolmanda eksoni kohalt. SXL valk on spalissingu regulaator ning ta kontrollib ka tema enda geenilt sünteesitud RNA splaissingut, olles seega omaenda positiivne regulaator.

Samuti reguleerib SXL geenilt tra (transformer) sünteesitud RNA splaissingut. Geneetiliselt isastel, kus SXL puudub, sisaldab tra mRNA stop koodoniga teist eksonit ja tulemuseks on lühikese polüpeptiidi süntees. Emastes, kus ekspresseerub SXL valk, sünteesitakse alternatiivse splaissingu tulemusena täispikk TRA valk.

Ka TRA valk on RNA protsessingu regulaator: ta kontrollib tra2 ja autosoomse geeni dsx (doublesex) ekspressiooni. TRA valgu olemasolul protsessitakse dsx transkript nii, et sellelt transleeritakse DSX valk, mis pärsib nende geenide avaldumise, mis kodeerivad valke isaste sootunnuste arenguks. Selle tagajärjel arenevad embrüol emaste sootunnused. XY embrüos toimub aga dsx transkripti alternatiivne splaissing, nii et vastavalt mRNA-lt transleeritud valk pärsib nende geenide avaldumise, mille tulemusena areneksid emaste isendite sootunnused. Sellised embrüod arenevad fenotüübilt isasteks.

Soo määramine C. elegans’il.

Soo määramisel osaleb vähemalt 10 geeni. Mutatsioonid geenides tra-1 ja tra-2 põhjustavad XX embrüode arenemise isasteks, mis näitab, et nende geenide normaalsed alleelid kodeerivad valke, mida on vaja hermafrodiitide arenguks. Mutatsioon geenis her-1 põhjustab aga XO embrüode arenemise hermafrodiitideks (normaalne geeniprodukt tagab organismi arengu isaseks). Kolme erinevat fem geenide produkti vajatakse samuti isaste arenguks. XO isendite puhul interakteerub sekreteeritud her-1 geeni produkt tra-2 geeni produktiga ning inaktiveerib selle. Selle tulemusena aktiveeruvad fem geenide produktid ning inaktiveerivad tra-1 geeni produkti, mis on aktivaatoriks hermafrodiitide kujunemisel. XX embrüode puhul geeni her-1 produkti ei sünteesita ning tra-2 valk jääb aktiivseks, inaktiveerides fem geenide poolt kodeeritud valgud. Selle tulemusena jääb aktiivseks ka aktivaatorvalk, mis on geeni tra-1 produkt.

Geneetiliste mosaiikide kasutamine arenguprotsesside uurimiseks.

Kõik multirakulised organismid arenevad viljastatud munaraku mitootilise jagunemise tulemusena. Rakkude fenotüübilised erinevused erinevates kudedes ja organites tulenevad geenide avaldumise erinevast mustrist. Genotüübilt on kõik rakud identsed. Harva tuleb ette ka mitoosihäireid, kus tütarrakud on genotüübilt erinevad. Need rakud jagunevad omakorda, olles aluseks geneetiliselt erinevatele kloonidele. Organisme, mis sisaldavad geneetiliselt erinevaid kloone, nimetatakse geneetilisteks mosaiikideks. Geneetiliste mosaiikide uurimine võimaldab täpsemalt selgitada, millised geenid milliseid arengufaase ja millal mõjutavad.

X kromosoomi kaotsiminek Drosophila rakkudest.

Kui üks X kromosoom läheb mitoosi käigus kaotsi varajases embrüostaadiumis, arenevad XX/XO mosaiigid kärbesteks, kellel on nii isaste ja kui ka emaste tunnuseid. Neid nimetatakse güandromorfideks. XX rakkudest diferentseeruvad emasorganismile iseloomulikud struktuurid, XO rakkudest aga isastele iseloomulikud struktuurid. Kaks esimest jalga on iseloomulikud isastele (on harjadega), pea ja rinnaku vasak pool on iseloomulikud emastele, paremad pooled aga isastele, kus lisaks ilmnevad X-liitelised mutatsioonid (eosiini värvi silm ja harali harjased). Selline fenotüüp näitab, et sooline determinatsioon toimus kõigis rakkudes ning rakkudevaheline kommunikatsioon näiteks hormoonide kaudu ei oma sel juhul ei mingit rolli. Seega toimub Drosophila seksuaalne areng kõigi rakkude puhul autonoomselt (cell-autonomous process).

Drosophila homoloogiliste kromosoomide somaatiline rekombinatsioon.

Geneetilised mosaiigid tekivad ka siis, kui somaatiliste rakkude homoloogilised kromosoomid omavahel rekombineeruvad. See sündmus toimub väga harva, kuid rekombinatsiooni on võimalik stimuleerida, kui kiiritada arenevaid organisme röntgenkiirtega. Kiirguse toimel tekivad katked DNA ahelates ning see omakorda indutseerib rekombinatsiooni toimumist homoloogiliste kromosoomide vahel. Kui eelnevalt olid rakud heterosügootsed teatava mutatsiooni suhtes, siis rekombinatsiooni tulemusena võivad eelnevalt replitseerunud kromosoomidest pärinevad tütarkromatiidid vahetada geneetilist materjali. Mitoosi tulemusena võivad kromatiidid lahkneda nii, et tütarrakud on teatavate geneetiliste lookuste suhtes homosügootsed ning sel juhul avaldub ainult mutantseid alleele sisaldavates rakkudes mutantne fenotüüp (näiteks erinev pigment harjastel). Mosaiiksuse ulatus, laikude suurus, sõltub sellest kui varajasel arenguetapil rekombinatsioon on toimunud: mida varem see toimub, seda suuremad on laigud.

Organismide arengus osalevate geenide molekulaarne analüüs.

Drosophila puhul on võimalik lokaliseerida kloneeritud geene, kasutades in situ hübridiseerimist polüteenkromosoomidele. Sel juhul määratakse eelnevalt uuritava geeni nukleotiidne järjestus ning saadud informatsiooni põhjal sünteesitakse radioaktiivse või fluorestseeruva märgisega DNA või RNA, mis on uuritava geeniga komplementaarne. Märgistatud nukleiinhape hübridiseerub polüteenkromosoomi selle regiooniga, mis sisaldab huvipakkuvat geeni. Samuti on võimalik tuvastada spetsiifilisi RNA-sid erinevates kudedes erinevatel arengujärkudel ning kasutades uuritavate valkude vastaseid antikehasid, detekteerida antigeen-antikeha reaktsiooniga nende valkude olemasolu huvipakkuvas kohas. Kloneeritud geene on võimalik in vitro tingimustes muuta, viia siis areneva embrüo genoomi ning uurida, kuidas ja kas see mõjutab organismi arengut.

Positsiooniline informatsioon.

Rakkude jagunemise ja diferentseerumise suuna määrab positsiooniline informatsioon. Sellise informatsiooni alusel võivad näiteks teatud rakud migreeruda embrüo ühest osast teise. Osa rakke on arengu käigus määratud ka surema, minema apoptoosi. Molekule, mis vahendavad positsioonilist informatsiooni, nimetatakse morfogeenideks. Morfogeenide toime avaldub läbi nende kontsentratsioonigradiendi. Morfogeeni efekt avaldub teatava piirkontsentratsiooni korral. Erinevate morfogeenide kontsentratsioonigradiendid äädikakärbse ootsüüdis on aluseks kõht-selg ning esiosa-taguosa teljestiku väljakujunemiseks. Morfogeenide gradient moodustub ka siis, kui teatavad rakud sünteesivad ja sekreteerivad vastavat morfogeeni, mis seejärel transporditakse naaberrakkudesse. Vastavat protsessi nimetatakse induktsiooniks.

Näiteks bicoid mRNA transporditakse toiterakkudest ootsüüti. Selle mRNA mõjul toimub arenevad keha esiosa rakud.

Lisaks morfogeenidele võib rakk saada positsioonilist informatsiooni ka adhesiooni teel. Rakupinnal on CAM retseptorid (cell adhesion molecules), mille abil ta kleepub teda ümbritsevate rakkude külge. Spetsiifiliste retseptorite olemasolu määrab adhesiooni toimumise.

Emapoolse mõjuga geenid.

Munaraku kasvamiseks ja valmimiseks ning viljastumisjärgseks embrüo arenguks transporditakse munarakku teda ümbritsevatest rakkudest toitaineid ja komponente, mis on olulised embrüo arenguks. Mõnede liikide puhul määravad need komponendid embrüo põhiplaani, pea-saba ning kõht-selg eristumise.

Mutatsioone ema geenides, mis ei mõjuta ema enda eluvõimelisust ega munarakkude valmimist, kuid mõjutavad järglaste arengut, nimetatakse emapoolse mõjuga mutatsioonideks (maternal-effect mutations), kuna ema mutantne genotüüp avaldub järglaste fenotüübis. Geene, mille muteerumine sellist efekti põhjustab, nimetatakse emapoolse mõjuga geenideks (maternal-effect genes). Näiteks võib tuua Drosophila geeni dorsal (dl). Retsessiivne mutatsioon selles geenis ei võimalda eluvõimelisi järglasi saada siis, kui ristata mutantseid homosügootseid emaseid metsiktüüpi homosügootsete isastega. Retsiprooksel (vastupidisel) ristamisel – metsiktüüpi homosügootsed emased mutantsete homosügootsete isastega – on järglaskond aga eluvõimeline. Seega avaldub letaalne mõju järglaskonnale ainult emapoolselt. Selgus, et dorsal geen kodeerib transkriptsioonifaktorit, mida emaorganismis sünteesitakse oogeneesi ajal ja säilitatakse munarakus. Sellel transkriptsioonifaktoril on embrüo arengu varajases staadiumis oluline roll. Ta määrab selle, kuhu tekib embrüo kõhtmine ja kuhu selgmine pool. Mutatsiooni korral kõhtmist poolt ei arene ning embrüo on kahe selgmise poolega. Isapoolne metsiktüüpi alleel embrüos ei avaldu, sest vastavat geeni sel arengujärgul ei transkribeerita.

Selg-kõht ning esiosa-taguosa teljestiku määramine Drosophila embrüos

Bilateraalse sümeetriaga loomadel on kaks põhilist kehatelge – telg, mis eristab selja kõhust (dorsaalse ventraalsest) ning pikitelg, mis eristab esiosa taguosast (anterioorse posterioorsest). Drosophila’l moodustuvad need teljed väga varajases embrüostaadiumis. Eelpool mainitud geeni dorsal poolt kodeeritud transkriptsioonifaktor siseneb blastula moodustumise ajal embrüo kõhtmise poole tuumadesse ning aktiveerib transkriptsiooni geenidelt twist ja snail ja represseerib transkriptsiooni geenidelt zerknullt (saksa k. “kägardunud”) ja decapentaplegic (kreeka k. “viieteist-jutiline”). Seal diferentseeruvad rakud embrüonaalseks mesodermiks. Kuna vastasküljel kahte esimest geeni ei aktiveerita ning teised kaks avalduvad, diferentseeruvad rakud embrüonaalseks epidermiks.

Mis määrab selle, et transkriptsioonifaktor siseneb ainult embrüo ühel küljel olevatesse tuumadesse? Oogeneesi ajal sünteesitakse produkte, mis on folliikulirakkudele diferentseerumise signaaliks – folliikulid diferentseeruvad dorsaalseks ja ventraalseks tüübiks. Geeniproduktid ventraalsetest folliikulitest annavad signaali üle ootsüüdi ventraalsele (kõhtmisele) küljele. Signaal kandub membraanseoselisele retseptorvalgule (geeni toll produkt), mis selle tagajärjel aktiveerub ning stimuleerib transkriptsioonifaktori sisenemist.

Embrüo esiosa-taguosa telje määrab geeni hunchback poolt kodeeritud transkriptsioonifaktori asümeetriline süntees. Ka seda geeni transkribeeritakse oogeneesis, kuid mRNA jaotub ootsüüdis ühtlaselt. Translatsioon sellelt mRNA-lt toimub ainult embrüo esiosas, tagumises pooles vastav RNA degradeeritakse. Geenilt nanos toiterakkudes sünteesitud RNA siseneb ootsüüdi tagumisse poolde ning sellelt sünteesitakse valk, mille kontsentratsioon jääb kõrgeks ootsüüdi tagaosas, madalaks aga esiosas. See valk takistab tagaosas hunchback RNA translatsiooni ja soodustab RNA 3’ UTR järjestusele seondumisega RNA degradatsiooni. Ootsüüdi esimesse poolde koguneb toiterakkude poolt sünteesitud geeni bicoid mRNA, millelt transleeritakse transkriptsioonifaktor, mille kontsentratsioon jääb kõrgemaks esiosas. See faktor aktiveerib embrüos mitmetelt geenidelt transkriptsiooni, kaasa arvatud geenilt hunchback, mille tagajärjel suureneb hunchback transkriptsiooni aktivaatori hulk esiosas veelgi. Selle tulemusena aktiveeritakse geenid, mis vastutavad areneva organismi esiosale iseloomulike struktuuride moodustumise eest.

Geenide aktivatsioon sügoodis.

Kuigi Drosophila embrüo arenemise kõige varajasemad etapid on kontrollitud ema poolt sünteesitud faktorite kaudu, siis embrüo arenemise teataval etapil aktiveeruvad selektiivselt embrüo rakkude geenid. Seda protsessi nimetatakse sügootiliste geenide aktivatsiooniks. Esimeste geenide aktivatsioon toimub vastusena ema poolt sünteesitud faktoritele. Arengukäigus avalduvad kaskaadselt järgmiste geenide rühmad.

Keha segmentatsioon

Paljudel selgrootutel on keha segmenteerunud. Äädikakärbsel on keha jaotunud peaks, kolmeks rinnakusegmendiks ja kaheksaks tagakeha segmendiks. Need segmendid on eristatavad ka embrüo- ja vastsestaadiumis. Selgroogsete täiskasvanud isendite puhul pole segmentatsioon nii ilmne, kuid esineb embrüostaadiumis, kui närvikiud kasvavad välja tsentraalsest närvisüsteemist erinevate kehaosade innerveerimiseks.

Homeootilised (homeotic) geenid. Äädikakärbse puhul on kirjeldatud mutatsioone, kus keha ühed segmendid on asendunud teistega. Kõige klassikalisemateks näideteks on mutatsioonid antennopedia, kus tundlad vahetuvad jalgadega ning bithorax, kus kärbse kolmas rinnaku segment on muutunud teise segmendi sarnaseks (ilmneb teine paar tiivalaadseid moodustusi). Mõlemad mutatsioonid on tekkinud homeootilistes geenides. Need geenid moodustavad ühes autosoomis kaks suurt klastrit – Bithorax Complex BX-C, milles on kolm geeni ja Antennopedia Complex ANT-C, mis sisaldab viit geeni. Nende geenide molekulaarsest analüüsist selgus, et nad kodeerivad kõik heeliks-pööre-heeliks tüüpi transkriptsioonifaktoreid konserveerunud regiooniga 60 aminohappe ulatuses. Seda regiooni nimetatakse homeodomeeniks ning see vastutab DNA-ga seondumise eest. Kuna homeootilised geenid määravad selle, millised kehasegmendid arenevad, vallandades nende poolt kontrollitavate geenide kaskaadse avaldumise, nimetatakse neid selektorgeenideks. Siiski ei asu homeootilised geenid selle kaskaadse regulatsiooni tipus, vaid on omakorda kontrollitavad segmentatsioonigeenide poolt.

Segmentatsioonigeenid. Neid geene on kolm gruppi:

1) gap geenid – määravad arenevas embrüos segmentide piirkonnad, on oma toimelt transkriptsioonifaktorid ning on kontrollitavad emapoolsete geenide bicoid ja nanos poolt. Mutatsioonide tagajärjel nendes geenides puuduvad paljud segmendid.

2) pair-rule geenid – määravad segmentide mustri arenevas embrüos. Nad on reguleeritud gap geenide poolt ja nende RNA ekspresseerub embrüo pikiteljes seitsme in situ hübridisatsioonil jälgitava vöödina. Nende geenide produktid määravad embrüo diferentseerumise 14-ks erinevaks tsooniks – parasegmendiks. Mutatsioon suvalises neist geenidest kutsub esile ainult poolte segmentide moodustumise.

3) segment-polarity geenid – määravad pikiteljel paiknevate individuaalsete segmentide esimese ja tagumise poole. Näiteks mutatsioon geenis gooseberry põhjustab kõigi segmentide tagumise osa asendumist temaga külgneva segmendi esimese poolega.

Homeootilised geenid on kontrollitavad kahe esimese segmentatsioonigeenide grupi poolt.

Rakutüüpide spetsialiseerumine.

Rakkude spetsialiseerumine sõltub rakkudevahelistest interaktsioonidest. Seda on põhjalikult uuritud Drosophila silma arengul. Algselt moodustunud kaheksa raku R1, R2,…R8 kogumik diferentseerub fotoretseptoriteks. Rakud diferentseeruvad erineval ajal. Näiteks R7 saab signaali diferentseerumiseks R8-lt, mis on juba diferentseerunud.

Organite moodustumine.

Kui erinevat tüüpi diferentseerunud rakud on organiseerunud kindlal viisil, moodustavad nad organi. Organid moodustuvad kindlasse kehaosasse. Oleks ju veidi kummaline, kui näiteks kärbse silmad asuksid rinnakul ja süda töötaks peas. Organite moodustumine õigetesse kehapiirkondadesse on väga täpselt geneetiliselt kontrollitud. Näiteks geen eyeless kodeerib homeodomeeni sisaldavat transkriptsioonifaktorit, mis lülitab tööle tuhandeid geene, et toimuks silma areng. Kui panna geen eyeless avalduma kudedes, kus ta normaalselt ei avaldu, indutseeritakse ka seal silmade teke. Seda saab teha, kloneerides geeni promootori alla, mis töötab uuritavates kudedes. Leiti, et hiire eyeless geeni homoloog on Drosophila genoomi viiduna samuti võimeline stimuleerima Drosophila silmade arengut. Hiires on kirjeldatud selle geeni mutatsioon small eye, mis mõjutab silmade suurust. Vastavad homoloogid on leitud ka inimesel. See näitab, et kõik need kolm geeni on omavahel suguluses ja pärinevad ühiselt eellaselt.

Selgroogsete arengu geneetiline analüüs.

Selgroogsete arengu geneetilist kontrolli aitab mõista selgrootute teadaolevate geenide homoloogide isoleerimine ja iseloomustamine selgroogsetel organismidel, kaasa arvatud inimene. Samuti uuritakse organismide arengu geneetilist kontrolli, kasutades mudelorganisme, eelistatult hiirt.

Selgrootute geenide homoloogid selgroogsetel.

Kui geen on kloneeritud, saab seda kasutada sondina homoloogide leidmiseks teistes organismides. See metoodika töötab hästi siis, kui geen on tugevalt konserveerunud ka üksteisele evolutsiooniliselt kaugete liikide puhul. Nii on leitud selgroogsetel homoloogid Drosophila homeootilistele geenidele. Neid homolooge on hakatud nimetama Hox geenideks. Nii on leitud inimesel ja hiirel 38 Hox geeni. Need geenid asetsevad neljas erinevas klastris HoxA, HoxB, HoxC ja HoxD, mis paiknevad erinevates kromosoomides. DNA järjestuse analüüs viitab sellele, et need 4 klastrit on tekkinud algse klastri neljakordistumise tulemusena 500 – 600 miljonit aastat tagasi. Geenide organisatsioon on üldjoontes evolutsiooni vältel säilunud. Geenide kolineaarsuses (nende transkriptsiooni suund ja järjekord ühtivad erinevates organismides) viitab sellele, et nende geenide vahendatud embrüo varajane areng toimub sarnaste molekulaarsete mehhanismide alusel nii äädikakärbsel kui inimesel ja hiirel.

Hiirte kasutamine mudelorganismina.

Äädikakärbse arengu geneetilist regulatsiooni uurides isoleeriti esmalt mutandid ja seejärel isoleeriti vastavad geenid. Kuna hiire Hox geenid on homoloogilised äädikakärbse homeootilistele geenidele, kasutati hiire homoloogide isoleerimiseks hiire geenipangast äädikakärbse geenide-spetsiifilisi märgistatud DNA proove.

Võrreldes Drosophila’ga on katsed hiirtega tunduvalt aeganõudvamad ja kulukamad. Hiirte puhul on konstrueeritud mutante, inserteerides hiire genoomi teatava geneetilise markeriga DNA-d. Võrreldes spontaansete mutatsioonidega on insertsioonilisi mutatsioone sisaldavaid geene kergem identifitseerida, sest inserteerunud DNA-d saab kasutada sondina huvipakkuva geeni isoleerimisel mutantse isendi DNA-st.

Organismi, mille genoomi on viidud võõrast DNA-d, nimetatakse transgeenseks. Transgeenide tekitamiseks on kaks põhilist meetodit:

1) DNA süstimine viljastatud munarakku või embrüosse.

2) DNA süstimine noore embrüo rakkudest kasvatatud rakukultuuri või selle rakukultuuri transfekteerimine DNA-ga. Need embrüootilised tüvirakud (embrüonic stem cells) e. ES rakud isoleeritakse blastulast. Pärast võõr-DNA sisestamist viiakse ES rakud mõnda teise arenevasse embrüosse ning osa neist on aluseks organismi kudede moodustumisel. Sel viisil saadud organismid sisaldavad normaalseid ja mutantseid rakke, mistõttu neid nimetatakse kimäärideks. Juhul kui mõni mutantne rakk on olnud aluseks sugurakkudele, kandub mutatsioon ka järglastele.

Kasutades kloneeritud geene, on võimalik konstrueerida “knockout” mutante. Sel juhul rikutakse kloneeritud geeni funktsioon ja asendatakse normaalne geen hiire organismis rikutuga. DNA viimine hiire rakkudesse toimub samal viisil nagu juba eelpool kirjeldati. Defektse geeni asendumine normaalsega toimub homoloogilise rekombinatsiooni teel. Heterosügootseid knockout mutatsiooni kandvaid hiiri ristates saame homosügootsed järglased, kelle arengut jälgides on võimalik uurida mutantse geeni mõju organismi arenguprotsessile.

Geneetilise alalüüsi tulemused, mis on saadud katsetest hiirtega, lubavad teha järeldusi ka inimese arengu geneetilise regulatsiooni kohta. Nii on mõlema organismi puhul kirjeldatud mutatsioone, mis viivad samadele väärarengutele. Näiteks võib mutantidel olla rikutud vasak-parem sümeetriatelg, mille tulemusena süda paikneb keha telje keskel.

Taimede areng.

Taimede areng erineb loomade omast:

1) Ei toimu rakkude migreerumist;

2) Ootsüüdis puudub morfogeenide gradient;

3) Taimerakud on totipotentsed.

Loomade arengu puhul on juba embrüo väga varajases arengustaadiumis määratud erinevate kehaosade paiknemine. Taimedel eristub ainult juurte ja võrsete meristeem. Ka taimede puhul on isoleeritud 3 klassi homeootilisi geene. Need geenid kodeerivad transkriptsioonifaktoreid, mis kontrollivad organite arengut. Homeootiliste geenide inaktiveerumise tulemusena võivad jääda välja kujunemata näiteks teatavad õie osad või on need moondunud.

24. Selgroogsete immuunsüsteemi geneetiline kontroll.

Immuunsüsteem kaitseb meie organismi patogeensete viiruste, bakterite, seente ja muu organismile võõra materjali vastu. Häired immuunsüsteemis vähendavad organismi vastupanu haigustele ning lõpptulemuseks on organism haigustest nii kurnatud, et sureb. Immuunsüsteemi defektsust põhjustab ka AIDS.

Imetajate immuunsüsteemi komponendid.

Kuna patogeenid, eriti viirused, evolutsioneeruvad väga kiiresti, peab meie immuunsüsteem suutma väga kiiresti nendele muutustele reageerida ning töötama välja uued kaitsevahendid.

Immuunsüsteemi iseloomustab tema spetsiifilisus. Spetsiifilisus on tagatud tänu kolmele põhikomponendile:

1) koordineeritult töötavad spetsialiseerunud rakud,

2) antikehad ja T rakkude retseptorid, mis tunnevad ära võõraid substantse,

3) spetsiaalsed koesobivusantigeenid, mis hõlbustavad rakkudevahelist kommunikeerumist, võimaldavad immuunsüsteemi rakkudel ära tunda võõraid substantse ning eristada organismile võõraid rakke omadest.

Täiskasvanud inimese immuunsüsteemis osaleb ligi 10¹² valget vererakku ning 10¹⁵ spetsiaalset valgumolekuli. Kui näiteks viirus või bakter satub inimese kehasse, tuntakse see ära immuunsüsteemi rakkude poolt, mille tulemusena produtseeritakse kahte tüüpi valke – antikehasid ning T rakkude retseptoreid, mis seonduvad spetsiifiliselt võõra substantsiga. Antikehaga või T rakkude retseptoriga seondunud substantsi nimetatakse antigeeniks, ning antigeeni, mis kutsub esile immuunvastuse, nimetatakse immunogeeniks. Peaaegu kõik bioloogilised makromolekulid (polüpeptiidid, polüsahhariidid, nukleiinhapped) on võimelised toimima antigeenidena ning enamus neist käituma immunogeenidena.

Imetajate immuunvastust võib käsitleda kahekomponentsena:

1) antikehade poolt vahendatud e. humoraalne vastus,

2) T rakkude poolt vahendatud e. rakuline vastus.

Humoraalse immuunvastuse korral sekreteeritakse produtseeritud antikehad kehavedelike ringlussüsteemi, kus nad seonduvad antigeenidega. Antikeha-antigeenkompleksid haaratakse spetsiaalsete valgete vererakkude poolt ning hävitatakse. Humoraalne immuunsüsteem kaitseb peamiselt organismi rakke võõraste rakkude (bakterid, seened) ja vabade viiruspartiklite infektsiooni eest.

Rakulise immuunvastuse korral sünteesitakse spetsiaalsete valgete vererakkude pinnale T rakkude retseptoreid. Need retseptorid võimaldavad valgetel vererakkudel ära tunda ja hävitada peremeesorganismi võõrmaterjaliga nakatanud rakke. Seega kaitseb rakuline immuunsüsteem organismi peamiselt viirusinfektsiooni vastu.

Spetsiaalsed rakud, mis osalevad immuunvastuses.

Immuunvastuses võõra substantsi vastu osalevad koordineeritult kõrgelt spetsialiseerunud rakud. Kõik need pärinevad mittediferentseerunud eellasrakkudest, mida nimetatakse tüvirakkudeks (stem cells) ja mis asuvad luuüdis. Eristatakse kahte põhilist rühma:

1) B lümfotsüüdid, mida kutsutakse ka B rakkudeks, kuna nad valmivad luuüdis (ingl. k. “bone marrow);

2) T lümfotsüüdid, mida kutsutakse ka T rakkudeks, kuna nende diferentseerumine toimub tüümuses.

Eraldi grupi moodustavad veel fagotsüüdid (siia kuuluvad ka makrofaagid).

Vastava signaali saabumisel diferentseeruvad B lümfotsüüdid plasmarakkudeks (plasma cells), mis produtseerivad antigeenidega seonduvaid valke (antikehi) ja B mälurakkudeks (memory B cells), mis on siis, kui nad puutuvad uuesti sama antigeeniga kokku kunagi hiljem, võimelised väga kiiresti antikehi produtseerima.

T lümfotsüüdid diferentseeruvad nelja tüüpi rakkudeks:

1) tsütotoksilised e. tapjad T rakud (killer T cells) – kannavad raku pinnal paiknevaid antikehadega seonduvaid T rakkude retseptoreid ning hävitavad vastavaid antigeene eksponeerivaid rakke;

2) abistavad T rakud (helper T cells) - stimuleerivad B ja T lümfotsüütide diferentseerumist antikehasid tootvateks plasmarakkudeks ja tapjateks T rakkudeks;

3) supressor T rakud (supressor T cells) – suruvad alla plasmarakkude tapjate T rakkude aktiivsuse;

4) T mälurakud (memory T cells) – mäletavad antigeeni ning nende uuesti sama antigeeniga kokkupuutumisel moodustuvad kiiresti tapjad T rakud e. killerid.

Valgud, mis tagavad immunuloogilise äratundmise.

1. Humoraalne immuunvastus.

Antikehad, mis tagavad humoraalse immuunvastuse, kuuluvad valkude klassi, mida nimetatakse immunoglobuliinideks. Iga antikeha on tetrameerne valk, mis koosneb neljast poüpeptiidist – kahest identsest kergest ahelast ning kahest identsest raskest ahelast, mis on omavahel ühendatud disulfiidsildadega. Kerged ahelad on ligikaudu 220 aminohappe pikkused, rasked ahelad 440 – 450 aminohappe pikkused. Nii kergete kui ka raskete ahelate N-terminaalsed otsad on varieeruvad (variable regions) ning spetsiifilised erinevatele antigeenidele. Mõlemate ahelate C-terminaalsed otsad on konstantsed (constant regions). Samasse immunoglobuliinide (Ig) klassi kuuluvatel antikehadel on need regioonid aminohappeliselt järjestuselt identsed sõltumata antikeha antigeen-spetsiifilisusest. Varieeruvad regioonid on ligi 110 aminohappe pikkused.

Kõigil antikehadel on kaks antigeenidega seondumise domeeni, mis sisaldavad kergete ja raskete ahelate varieeruvaid regioone. Antigeen-antikeha interaktsiooni saab piltlikult ette kujutada nagu võtme sobitumist lukuauku. Antikeha raskete ahelate konstantsed regioonid moodustavad kolmanda domeeni – efektori funktsiooniga domeeni (effector function domain), mis vastutab antikeha interaktsioonide õigsuse eest teiste immuunsüsteemi komponentidega.

Antikehade kergeid ahelaid on kahte tüüpi – kapa ahelad (kappa chains) ja lambda ahelad (lambda chains). See, kumba tüübiga on tegemist, sõltub konstantsete regioonide struktuurist. Selle tulemusena võivad samu antigeene äratundvad antikehad olla erinevate immunoloogiliste funktsioonidega.

Antikehad grupeeruvad viide klassi IgA, IgD, IgE, IgG ja IgM. Antikeha funktsiooni ning tema kuuluvuse ühte neist klassidest määrab ära raskete ahelate konstantsete regioonide struktuur e. antikeha efektori funktsiooniga domeeni struktuur. Seega on ka raskeid ahelaid viit põhitüüpi. (Vt. Tabel 24.2.)

Immuunvastusena toimuva B rakkude diferentseerumise käigus produtseeritakse esmalt sekreteeritavaid IgM antikehi ning alles hiljem teiste klasside antikehi. IgG antikehad moodustavad inimese veres leiduvatest immunoglobuliinidest üle 80%. Neid produtseeritakse väga suurel hulgal sekundaarse immuunvastusena, kui toimub uuesti kokkupuude sama antigeeniga. IgA molekule leidub peamiselt süljes, pisarates ja piimas. IgE molekulid on erinevates kudedes paiknevate nuumrakkude membraanseoselised antigeenretseptorid. Antigeenide seondumine nuumrakkude pinnal olevatele retseptoritele vallandab histamiini ja teiste amiinide sekreteerumise, mis omakorda põhjustab astmat ja heinapalavikku põdevatel indiviididel allergilisi reaktsioone.

2. Rakuline immuunvastus.

Rakulise immuunvastuse puhul tuntakse antigeenid ära T rakkude retseptorite poolt. Iga T raku retseptor on dimeerne, koosnedes a- ja b-polüpeptiidist. Mõlemad polüpeptiidid sisaldavad N-terminaalseid varieeruvaid regioone ning C-terminaalseid konstantseid regioone. T rakkude retseptoritel on erinevalt antikehadest ainult üks antigeeniga seondumise ala. T rakkude retseptorid paiknevad tapjate (killer) T rakkude ja helper T rakkude pinnal ning seonduvad põhiliste koesobivusantigeenide abil antigeenidega.

Põhilised koesobivusantigeenid aitavad eristada võõrast omadest.

Omavahel mittesuguluses olevalt indiviidilt teisele organi transplanteerimine või naha ülekanne tavaliselt ebaõnnestub, kuna immuunsüsteem tõrjub transplanteeritud koed kõrvale. Samas identsete kaksikute puhul transplantatsioon üldjuhul õnnestub. Samuti võib samal indiviidil nahka ühest kohast teise istutada. Võõraste kudede eristamine organismi enda kudedest toimub tänu koesobivusantigeenidele (histocompatibility antigens). Kõige tähtsamaid nendest koesobivusantigeenidest nimetatakse põhilisteks koesobivuskompleksi (major histocompatibility complex – MHC) valkudeks. Inimesel nimetatakse MHC valke HLA antigeenideks (human-leucocyte-associated antigens), kuna nad avastati leukotsüütide pinnal. HLA antigeenid on kodeeritud suure geenide klastri poolt, mida nimetatakse HLA lookuseks ja mis paikneb 6-ndas kromosoomis.

HLA lookuse geenide polümorfism on väga suur, mis väljendub selles, et mõnel geenil on kirjeldatud kuni sada või enam alleeli. Seega on tõenäosus, et kaks omavahel mittesuguluses olevat indiviidi kannaksid kõigi HLA geenide samu alleele, ülimalt väike. Seega on sobivate organidoonorite leidmine komplitseeritud.

HLA geenid kodeerivad kolme erinevat klassi valke:

1) Klassi I kuuluvad HLA geenid kodeerivad transplantatsiooni antigeene (transplantation antigens). Nimetus tuleneb sellest, et just need valgud vastutavad transplanteeritud kudede tagasitõrjumise eest. Neid nimetatakse ka MHC klass I valkudeks. Need valgud on oma olemuselt glükoproteiinid, mis on ankurdunud rakumembraanile, nii et antigeenne determinant ulatub rakust välja. Transplantatsiooniantigeenid esinevad praktiliselt kõigil rakkudel ning aitavad killer-rakkudel (tapjad T rakud) eristada võõraid rakke omadest. Sellesse klassi kuuluvad valgud võivad seonduda küllaltki erinevate antigeenidega teiste rakkude pinnal ja esitada võõraid antigeene eksponeerivaid rakke killeritele.

2) Klassi II kuuluvad HLA geenid kodeerivad valke, mis asuvad peamiselt B lümfotsüütide ja makrofaagide pinnal (need on rakud, mis interakteeruvad helper T rakkudega). Need on heterodimeersed valgud, mis koosnevad kahest polüpeptiidist. Polüpeptiidide polümorfsed N-terminaalsed domeenid rakupinnal moodustavad vao, kuhu võib seonduda küllaltki lai valik erinevaid antigeene.

3) Klassi III kuuluvad HLA geenid kodeerivad komplement-valke (complement proteins), mis interakteeruvad antikeha-antigeen kompleksidega ning aitavad neid proteolüütiliselt degradeerida. Komplement-valgud tapavad ka võõra bioloogilise materjaliga nakatunud rakke, lõhkudes nende rakkude membraane.

Immuunvastus imetajatel.

Immuunvastus toimib kolmeetapiliselt:

1. Võõra bioloogilise materjali äratundmine.

2. Informatsiooni edastamine vastavatele rakkudele.

3. Võõrmaterjali hävitamine.

Mõned immuunvastuse komponendid on suunatud igasuguse võõrmaterjali vastu ning nende poolt vahendatud immuunvastust nimetatakse mittespetsiifiliseks immuunvastuseks. Sel viisil toimub näiteks viiruste, bakteri- ja seenerakkude hävitamine makrofaagide poolt. Kõige olulisem immuunvastus on aga antigeen-spetsiifiline ning seda kutsutakse spetsiifiliseks immuunvastuseks, mille käigus sünteesitakse nii antikehasid kui ka produtseeritakse tapjaid (killer) T rakke.

Antikehade poolt vahendatud humoraalne immuunvastus.

Kui võõras antigeen, näiteks bakteriraku pinnal olev glükoproteiin satub imetajate vereringesse, käivitub antikeha-vahendatud e. humoraalne immuunvastus. B rakkudest diferentseerunud plasmarakkude poolt sünteesitakse antikehad, mis seonduvad antigeeniga väga spetsiifiliselt. Antigeeni piirkonda, mille vastu konkreetne antikeha sünteesitakse (mida antikeha spetsiifiliselt ära tunneb ja seob), nimetatakse epitoobiks. Paljud antigeen-antikeha kompleksid degradeeritakse fagotsüütide poolt. IgG ja IgM antikehad kutsuvad kohale komplement-valke, mis degradeerivad võõrvalke proteolüütiliselt ning hävitavad seente ja bakterite rakke nende lüüsimise teel.

Antikeha-vahendatud immuunvastuse tekkel on suur osatähtsus helper T rakkudel. Kui makrofaagid asuvad hävitama võõraid rakke, näiteks bakterirakke, satuvad osaliselt degradeeritud bakterite antigeenid makrofaagide pinnale, kus nad tuntakse ära helper T rakkude poolt, mis seejärel omakorda stimuleerivad B rakkude diferentseerumist plasmarakkudeks (produtseerivad hulgaliselt antikehasid) ja mälurakkudeks (võimaldavad kiiret immuunvastust järgmistel kokkupuutumistel sama antigeeniga).

Iga B rakk sünteesib ainult ühte spetsiifilist antikeha. Antikeha seondumine antigeeniga stimuleerib B raku kiiret jagunemist, mille tulemusena tekib igast B rakust hulga sama antikeha tootvaid plasmarakke. Plasmarakk on võimeline sekundi jooksul sünteesima ja sekreteerima 2000 kuni 20000 antikeha. Kui võõras antigeen on organismi kehast kõrvaldatud, pärsivad supressor T rakud antikehade tootmise.

T rakkude vahendatud rakuline immuunvastus.

Rakulises immuunvastuses osalevad T killer-rakud (tapjad rakud), mis hävitavad organismile võõraid antigeene eksponeerivaid rakke. Lisaks bakterite, viiruste ja teiste patogeenide poolt nakatatud rakkude hävitavad nad ka mõnda tüüpi vähirakke. Antigeenid, mida tuntakse ära T rakkude retseptorite poolt, on tavaliselt fragmendid osaliselt degradeeritud viiruste ja bakterite valkudest. Need antigeenid on nakatatud rakkude pinnale esitatud põhiliste koesobivuskomplekside (MHC klass I valgud) poolt.

Nii nagu antikeha-vahendatud immuunvastuse korral, on ka T rakkude vahendatud immuunvastuse puhul stimuleerivaks see, kui makrofaag on degradeerinud osaliselt võõra bioloogilise materjali ning selle degradatsiooni produktid (antigeenid) paiknevad makrofaagi pinnal, eksponeerituna põhilise koesobivuskompleksi valkude poolt. Antigeenid tuntakse ära arenevate killer T rakkude ja helper T rakkude poolt. Sel viisil aktiveeritud helperrakud stimuleerivad B ja T lümfotsüütide arengut, sekreteerides tsütokiine, lümfokiine ja interleukiine. Küpsed T killer-rakud produtseerivad väga suurel arvul antigeen-spetsiifilisi T rakkude retseptoreid. Iga spetsiifilist retseptorit produtseeriv rakk annab pooldumise teel palju järglasi. Killer-rakud lüüsivad võõrast antikeha eksponeerivad rakke, sekreteerides valku nimetusega perforiin. See valk tekitab rakumembraani poore, mille kaudu tsütoplasma voolab rakust välja.

Immunoloogiline mälu. Primaarne ja sekundaarne immuunvastus.

Kui inimorganism puutub esimest korda kokku võõra antigeeniga, kulub enne nädal kuni 10 päeva, kui organismis on moodustunud märgatav kogus vastavale antigeenile spetsiifilist antikeha. Maksimaalne antikehade produktsioon saavutatakse alles kahe kuni kolme nädala pärast. Seda suhteliselt aeglast immuunvastust nimetatakse primaarseks immuunvastuseks. Teine kokkupuude sama antigeeniga kutsub aga esile kiire immuunvastuse, mida nimetatakse sekundaarseks immuunvastuseks. Sekundaarne immuunvastus annab ka kõrgema antikehade kontsentratsiooni. B ja T lümfotsüüte, mis pole kokku puutunud võõra antigeeniga, nimetatakse neitsilikeks või naiivseteks rakkudeks (virgin or naive cells). Pärast kokkupuudet antigeeniga diferentseeruvad neitsilikud rakud mälurakkudeks ning aktiveeritud B ja T rakkudeks. Aktiveeritud rakud paljunevad ning diferentseeruvad antikehasid produtseerivateks plasmarakkudeks ning retseptoreid produtseerivateks T rakkudeks. Erinevalt plasmarakkudest ning killer T rakkudest on mälurakud pikaealised – nad võivad organismis püsida kuid ja isegi aastaid. Mälurakud võivad järgmise kokkupuute korral konkreetse võõra antigeeniga väga kiiresti diferentseeruda plasmarakkudeks ning killer-rakkudeks, tagades sel viisil kiire immuunvastuse.

Antikehade mitmekesisuse geneetiline kontroll.

Imetajate organism on võimeline produtseerima spetsiifilisi antikehi suvaliste organismile võõraste antigeenide vastu. Tekib küsimus, kuidas on nii suur antikehade variantsus geneetiliselt määratud. Vastuseks on pakutud kolme erinevat hüpoteesi:

1. Igale antikehale vastab erinev geen. See idee vastas varasemale kontseptsioonile “üks geen – üks valk”. Just siin tekib vastuolu: genoom ei ole piisavalt suur, et kodeerida nii palju erinevaid polüpeptiide.

2. Somaatiliste mutatsioonide hüpotees. Antikehi produtseerivates rakkudes on kõrge mutatsioonisagedus, mille tulemusena antikehi kodeeruvad geenid muteeruvad väga kiiresti, mis võimaldabki sünteesida väga erinevaid antikehi.

3. Mini-geenide hüpotees. Antikehi kodeerivate geenide segmendid rekombineeruvad omavahel, tekitades sel viisil hulgaliselt uusi kombinatsioone.

Nagu senised uuringud on näidanud, ei seleta ükski hüpotees eraldivõetuna antikehade mitmekesisust. Pigem sisaldub neis kõigis aspekte, mida tuleks korraga jälgida.

Genoomi ümberkorraldused lümfotsüütide diferentseerumisel.

B rakkude diferentseerumisel toimuvad antikehi kodeerivate geenide vahel rekombinatsioonid, mille käigus osa segmente deleteerub. Ümberkorralduste mehhanism on üldjoontes sama nii lambda ja kapa kergete ahelate geenide kui ka raskete ahelate geenide puhul.

Lambda kerge ahela geenide assambleerumine toimub kahte tüüpi geenisegmentide baasil.

DNA järjestused, mis kodeerivad lambda kergeid ahelaid, esinevad kahte erinevat tüüpi geenisegmentidena. Ühte tüüpi geenisegmente tähistatakse L_lV_l (leader peptide – variable region). See segment kodeerib N-terminaalset hüdrofoobset liiderpeptiidi, mis lõigatakse ära pärast valmis poüpeptiidi transporti läbi kareda endoplasmaatilise retiikulumi membraani ning N-terminaalset 97 aminohappe pikkust varieeruvat regiooni. Teist tüüpi geenisegmente tähistatakse J_lC_l (joining segment – constant region). Need segmendid kodeerivad liitvat järjestust (joining sequence) ja C-terminaalset konstantset regiooni. Liitev järjestus kodeerib lambda kerge ahela varieeruvast regioonist 13 kuni 15 aminohapet ning liidab segmendi L_lV_l segmendiga J_lC_l, deleteerides vahepealse ala. Inimesel on teada ligi 300 erinevat L_lV_l segmenti kromosoomis 22 ning üheksa erinevat J_lC_l segmenti, mis paiknevad samas kromosoomis tsentromeerist kaugemal. Suvaline L_lV_l segment võib liituda suvalise J_lC_l segmendiga, nii et nende vahele jäävad segmendid deleteeruvad. Sel viisil moodustunud uued geenid sisaldavad kahte intronit – ühte eksonite L_l ja V_l vahel ning teist eksonite J_l ja C_l vahel. Pärast transkriptsiooni toimub nende intronite splaissing samade mehhanismide alusel nagu ka teistel geenidel.

Kapa kerge ahela geenide assambleerumine toimub kolme tüüpi geenisegmentide liitumise baasil.

Kapa kerge ahela sünteesil osalevad kolme tüüpi geenide segmendid:

1) segment L_kV_k kodeerib liiderpeptiidi ja 95 aminohappe pikkust varieeruvat regiooni;

2) segment J_k kodeerib ülejäänud 13 aminohapet varieeruvast regioonist;

3) segment C_k kodeerib C-terminaalset konstantset regiooni.

Inimese kromosoomis number 2 on 300 L_kV_k geenisegmenti, viis segmenti J_k ning üks C_k geenisegment. Algselt on viis J_k segmenti L_kV_k geenisegmentidest eraldatud pika mittekodeeriva järjestuse poolt ning C_k geenisegmendist 2 kb pikkuse mittekodeeriva järjestusega. Rekombinatsioni käigus diferentseeruvates B lümfotsüütides ühineb üks 300-st L_kV_k geenisegmendist suvalisega viiest J_k segmendist ning need omakorda segmendiga C_k. J_k ning C_k vahele jääv mittekodeeriv ala kõrvaldatakse pärast transkriptsiooni splaissingu teel. Liiderpeptiid kõrvaldatakse pärast sünteesitud polüpeptiidi transporti läbi membraani.

Raskete ahelate geenide assambleerumine toimub nelja tüüpi geenisegmentide liitumise baasil.

Segmentide liitumine toimub analoogiliselt kapa kerge ahela geenisegmentide liitumisele, kuid lisaks on veel üks 2 kuni 13 aminohappe pikkust varieeruvat regiooni kodeeriv segment D. Kõik segmendid paiknevad 12-ndas kromosoomis.

Signaaljärjestused, mis kontrollivad rekombinatsioonilisi sündmusi.

Segmentide omavaheline liitumine toimub lühikeste DNA järjestuste baasil, mis on iseloomulikud igale konkreetsele liitumistüübile. Näiteks kapa kerge ahela L_kV_k ja J_k liitumiskohale moodustub kindlaid 7 bp ja 9 bp pikkuseid järjestusi ning 12 ja 22 nt pikkuseid speisserjärjestusi sisaldav juuksenõelastruktuur.

Mitmekesisust suurendavad varieeruvus liitumiskohtades ning somaatilised mutatsioonid.

Lihtsad arvutused näitavad, et geenisegmentide kombineerimise tulemusena on võimlik sünteesida ligi 148,5 miljonit erinevat antikeha. Lisaks segmentide kombineerumisele on kirjeldatud ka teisi mehhanisme, mis suurendavad veelgi erinevate antikehade arvu. V–J liitumiskohtades on antikehade aminohappeline varieeruvus suurem, kui seda võiks eeldada algse nukleotiidse järjestuse põhjal. Selgus, et liitumine ei toimu alati täpselt kindlate nukleotiidide vahel, mistõttu võivadki ühenduskohtade järjestused veidi varieeruda.

Antikehade varieeruvaid regioone kodeerivates geenisegmentides on leitud ühenukleotiidseid asendusmutatsioone. Võrreldes diferentseerumata rakkude geneetilise materjaliga sisaldub neid antikehi produtseerivates rakkudes kuni 2%. Mehhanism, mis põhjustab antikehade varieeruvaid, antigeenidega seonduvaid piirkondi kodeerivates DNA järjestustes kõrge sagedusega mutatsioone, on seni selgitamata. Kuna need mutatsioonid toimuvad kõrge sagedusega, hakati neid nimetama somaatilisteks hüpermutatsioonideks. Nii või teisiti on somaatiliste hüpermutatsioonide toimumine organismile kasulik, kaitsmaks teda kiiresti evolutsioneeruvate patogeensete organismide vastu.

Rakkude ümberlülitumine ühte klassi kuuluvate antikehade tootmiselt teistesse klassidesse kuuluvate antikehade tootmisele

Sel ajal, kui arenevates B lümfotsüütides algab antikehade süntees, on kõik raske ahela konstantse ala geenisegmendid C_H olemas, olles teiste segmentide liitumisel moodustunud geenist eraldatud lühikese, mittekodeeriva järjestusega. Selles staadiumis sünteesitakse IgM tüüpi raske ahelaga antikehasid, mis sisaldavad konstantse regioonina C_Hm geeniprodukti. Mõne aja pärast hakkavad osa plasmarakke tootma ka teistesse klassidesse kuuluvaid antikehi, mis sisaldavad rasket ahelat IgA, IgD, IgE või IgG. Seda protsessi nimetatakse ümberlülitumiseks (class switching). Näiteks hakkavad mõned plasmarakud tootma nii IgM kui ka IgD klassi kuuluvaid antikehi, mis erinevad teineteisest ainult efektori funktsiooniga domeenide poolest. Antigeen-antikeha seondumise domeenid on neil identsed. Neis rakkudes toimub nii geeni C_Hm kui ka geeni C_Hd transkriptsioon ning RNA splaissingu käigus kõrvaldatakse üks järjestustest.

Üleminekul teistesse klassidesse kuuluvate antikehade tootmisele toimuvad ümberkorraldused genoomis, mille käigus osa C_H segmentidest deleteeruvad ning avaldub see raske ahela konstantset regiooni kodeeriv järjestus, mis külgneb vahetult geeniga.

IgM antikehasid on samuti kahte tüüpi. Immuunvastuse algstaadiumis sünteesivad B lümfotsüüdid membraanseoselisi IgM antikehasid, hiljem aga lülituvad sekreteeritavate antikehade tootmisele. Membraanseoseline ja sekreteeritav vorm erinevad teineteisest raskete ahelate C-terminaalse ala pikkuse poolest. Membraanseoselisel vormil on see 21 aminohapet pikem ja hüdrofoobne. Erinevused tulenevad rasket ahelat kodeeriva RNA alternatiivsest splaissingust.

T rakkude retseptorite geenide assambleerumine somaatilisel rekombinatsioonil.

Tsütotoksiliste killer T rakkude retseptorid tunnevad ära spetsiifiliselt teiste rakkude pinnal olevaid organismile võõraid antigeene, kontakteerudes samaaegselt nii antigeeniga kui ka seda antigeeni raku pinnal eksponeeriva põhilise koesobivuskompleksi MHC valguga. Nii nagu erinevaid antikehi, on ka erinevaid T rakkude retseptoreid väga palju ning nende mitmekesisuse tagab geenisegmentide rekombinatsioon. T rakkude polüpeptiidsed ahelad on kodeeritud nelja liitunud geenisegmendi L, V, D ja C poolt. Varieeruvaid regioone kodeerivaid geenisegmente on palju erinevaid, konstantset regiooni kodeerivaid segmente vähem. Geneetiliste ümberkorralduste üldpõhimõte diferentseeruvates T rakkudes on sama, mis B rakkudeski. Inimese a- ja b-polüpeptiide kodeerivete geenisegmentide klastrid paiknevad 14-ndas ja 7-ndas kromosoomis.

Immunoglobuliine kodeerivate geenide regulatsioon.

Tüvirakkudes on transkriptsiooni tase antikehi kodeerivatelt geenisegmentidelt väga madal. Plasmarakkudes moodustab aga antikehi kodeerivate geenide mRNA molekulide hulk rakkude kogu mRNA molekulidest 10 kuni 20%.

Alleelne välistamine.

Iga plasmarakk toodab ainult ühte tüüpi antikeha. Kuigi raku genoom on diploidne, toimuvad geneetilised ümberkorraldused ainult ühe alleeli ulatuses. Nähtust nimetatakse alleelseks välistamiseks. Teine alleel rakus ei avaldu. Alleelne välistamine toimub raskete ning kergete ahelate geenisegmentide puhul üksteisest sõltumatult. Kuna iga rakk produtseerib ainult ühte kindlat antikeha, mis seondub ainult ühe epitoobiga, võimaldab see toota monoklonaalseid antikehi, mida saab kasutada kindlate valkude tuvastamiseks ja lokaliseerimiseks.

Rasket ahelat kodeerivate geenide transkriptsioon.

Geneetiliste ümberkorralduste käigus arenevates B lümfotsüütides viiakse rasket ahelat kodeerivate geenide promootorid piirkonda, kus nad satuvad tugevate transkriptsiooni võimendavate järjestuste kontrolli alla.

Immuunsüsteemi haigused.

Immuunsüsteemi defektsuse korral on inimorganism kaitsetu teda väljastpoolt ründavate haigustekitajate suhtes. Tõsisemad immuunsüsteemi häired põhjustavad indiviidi enneaegse surma.

Päritavad immuunsüsteemi haigused.

Autoimmuunhaiguste puhul toodab indiviidi organism antikehi tema enda antigeenide vastu. Need antikehad kahjustavad organismi enda kudesid ja organeid. Kahjustustega kaasnevad tugevad valud. Autoimmuunhaigused on näiteks juveniilne diabeet ja hemolüütiline aneemia. Juveniilse diabeedi korral ründavad antikehad pankreases insuliini tootvaid beeta rakke. Insuliini puudumine viib pimedaks jäämisele, haigestub ka süda, neerud ei tööta korralikult ning haiged surevad enne täiskasvanuks saamist.

Kombineeritud immuundefektsuse sündroomi (severe combined immunodeficiency syndrome SCID) puhul ei teki ei antikehade ega ka T rakkude poolt vahendatud immuunvastust. Haigetel puuduvad funktsionaalsed B ja T lümfotsüüdid. SCID on pooltel juhtudel põhjustatud retsessiivsetest mutatsioonidest X kromosoomis. Autosoomsetest mutatsioonidest on ühel kolmandikul juhtudest toimunud mutatsioonid adenosiini deaminaasi (ADA) kodeerivas geenis. ADA-defektsuse tagajärjel akumuleerub organismi deoxyATP ning tema liigkõrge kontsentratsioon on T helper-rakkudele toksiline. Ilma T helper-rakkudeta ei toimu B ja T lümfotsüütide diferentseerumist antikehi tootvateks plasmarakkudeks ega T killer-rakkudeks. Haigus lõpeb lapse surmaga juba väga varajases eas.

X-liitelise agammaglobulineemia puhul pole indiviidi organism võimeline sünteesima antikehi. Tegemist on X-liitelise haigusega, kus B rakkude diferentseerumist ei toimu. Kuna seda haigust põdevatel indiviididel toimib T rakkude poolt vahendatud immuunvastus normaalselt, on nad kaitstud viirusinfektsioonide vastu, kuid on väga tundlikud bakteriaalsete ja seeninfektsioonide suhtes. Tänu luuüdi transplantatsioonidele (doonori luuüdi sisaldab normaalseid tüvirakke, mis on võimelised diferentseeruma ja tootma antikehi) on tänapäeval võimalik seda haigust ravida.

Omandatud immunodefektsus.

Immunodefektsus võib kujuneda välja ka loote arengu käigus või sünnijärgselt toksiliste kemikaalide või patogeensete mikroorganismide toimel.

DiGeorge sündroomi puhul ei ole organismi loote arengu käigus saadud kahjustuste tulemusena arenenud normaalselt funktsioneerivat tüümust, mistõttu haige organismis ei moodustu T rakke.

Omandatud immunodefektsuse sündroom (acquired immunodefeciency syndrome) AIDS on põhjustatud HIV (human immunodeficiency virus) poolt. HIV viirus nakatab ja hävitab T helperrakke. Selle tulemusena väheneb organismis T ja B lümfotsüütide diferentseerumine killer T rakkudeks ja plasmarakkudeks ning immuunvastus nõrgeneb järk-järgult kuni organism ei suuda enam toime tulla infektsioonidega ja sureb. HIV viirus siseneb helper T rakkudesse, seondudes nende rakkude pinnal olevatele CD4 retseptoritele. Just tänu nendele retseptoritele toimub ka T helperite interaktsioon teiste immuunrakkudega ning seetõttu on raske leida võimalust, kuidas tõkestada viiruse levikut. HIV on retroviirus. HIV-i genoomiks on RNA, millelt sünteesitakse pärast infektsiooni kaksikahelaline DNA. DNA integreerub genoomi ja võib seal pikka aega säiluda latentsena, proviirusena. Kui viiruse geenide transkriptsioon aktiveerub, sünteesitakse viirusspetsiifilisi valke ja RNA-d ning moodustuvad uued viiruspartiklid, mis nakatavad ja hävitavad helper T rakke. Kuigi pärast esmast HIV-I infektsiooni suudab organism viirusega võidelda, ei suuda ta seda täielikult elimineerida viiruse kiire muteerumise tõttu.