<tagasi

1.          Sissejuhatus: klassikaline ja molekulaargeneetika, geneetika rakendus kaasajal

 

 

Klassikalise ja molekulaargeneetika kujunemine

 

Geneetika on suhteliselt noor teadus. Kuigi pärilikkuse põhilised seaduspärasused esitas Gregor Mendel aastal 1865, tuleb geneetika sünniks lugeda siiski 20-nda sajandi algust. Alles siis taasavastati Mendeli ideed, mis said aluseks klassikalisele geneetikale. Tõendid selle kohta, et DNA kannab geneetilist informatsiooni, saadi 20-nda sajandi keskel. 1944. aastal kirjeldasid Avery ja ta kolleegid katseid, kus nad uurisid bakterite (Streptococcus pneumoniae) transformatsiooni rakkudest isoleeritud DNA-ga. Hersey ja Chase poolt aastal 1952 avaldatud tulemused kinnitasid seda, et DNA on pärilikkuse kandja. Nad näitasid, et bakteriviiruse T2 geneetiline informatsioon säilib DNA-s. 1953-ndal aastal avaldasid James Watson ja Francis Crick DNA kaksikhelikaalse struktuuri. Need avastused ja geneetilise koodi deshifreerimine said aluseks molekulaargeneetika sünnile. Uute molekulaarsete meetodite väljatöötamine 70-ndatel ja 80-ndatel aastatel võimaldas kasutusele võtta rekombinantse DNA tehnoloogia, täiustusid meetodid, mis võimaldavad määrata nukleiinhapete primaarstruktuuri. 1985-nal aastal Kary Mullise poolt väljatöötatud PCR (polümerase chain reaction) meetod võimaldab lühikese ajaga paljundada spetsiifilisi DNA lõike in vitro (katseklaasis) väga väikesest algmaterjali kogusest. Uute meetodite arsenal kasvab pidevalt, võimaldades üha täpsemalt selgitada geeneetiliste protsesside toimumist molekulaarsel tasemel. Ka geeni definitsioon on alates Mendeli poolt kasutatud “pärilikkuse ühikust” (siis veel terminit “geen” ei tuntudki) pidevalt täiustunud.

 

 

 

Geneetika rakendus kaasajal

 

Geneetiline informatsioon on salvestatud DNA nukleotiidses järjestuses ja kandub raku jagunemisel tütarrakkudesse geneetilise informatsiooni kandjate – kromosoomide duplitseerumise tulemusena. Enne raku jagunemist kaheks tütarrakuks toimub rakus DNA süntees – DNA replikatsioon, mille tulemusena saadakse igast algsest DNA molekulist koopia. Geenide avaldumine realiseerub informatsiooni edastamise teel DNA nukleotiidselt järjestuselt valkude aminohappelisse järjestusse. Esmalt kandub geneetiline informatsioon DNA-lt RNA-le – vastavat protsessi nimetatakse transkriptsiooniks. RNA molekulide nukleotiidses järjestuses salvestatud informatsiooni põhjal toimub valkude süntees – translatsioon. Seega liigub geneetiline informatsioon DNA-lt RNA-le ja RNA-lt valgule. Seda seaduspära nimetatakse molekulaarbioloogia põhidogmaks. Teatud viirustel, kelle genoomiks on RNA molekul (siia kuuluvad retroviirused, näiteks HIV), võib geneetiline informatsioon liikuda ka RNA-lt DNA-le. Informatsiooni liikumine RNA-lt valgule on aga alati ühesuunaline.

 

 

Rekombinantse DNA tehnoloogia

 

Kaasajal kasutatakse geenide molekulaarseks analüüsiks rekombinantse DNA tehnoloogiat. Tehnoloogia põhineb DNA fragmentide isoleerimisel genoomist ning viimisel väikestesse, rakus iseseisvalt replitseeruvatesse DNA molekulidesse – kloneerimisvektoritesse, mis võimaldavad rekombinantset DNA-d paljundada, saada selle paljundamisel koopiaid e. kloone. Vastavat protseduuri nimetatakse geenide kloneerimiseks. Kloneerimisel on mitmeid rakendusi:

          1) DNA primaarjärjestuse määramine e. sekveneerimine

          2) geeni(de) avaldumise regulatsiooni uurimine

          3) geenide poolt kodeeritud valkude funktsioonide uurimine

          4) geenitehnoloogia

 

Paljude kloneerimisvektorite konstrueerimisel on kasutatud bakteriofaagide genoomi ja bakterite kromosoomiväliseid elemente - plasmiide. Need võimaldavad huvipakkuvat DNA-d paljundada ja selles sisalduva geneetilise informatsiooni avaldumist uurida bakterirakus. Lisaks on konstrueeritud hulgaliselt ka eukarüootseid vektoreid, mis põhinevad enamasti eukarüoodi viiruste genoomidel. Huvipakkuvat DNA lõiku on võimalik vektorisse viia sel viisil, et nii vektorit kui ka seda DNA-d, millest soovitakse paljundada huvipakkuvaid geene, töödeldakse restriktaasidega. Restriktaasid on ensüümid, mis teevad DNA ahelatesse katked kindla nukleotiidse järjestuse kohalt. Seejärel liidetakse huvipakkuva DNA lõigu ja vektori DNA ahelate otsad ensüümiga DNA ligaas. Saadakse rekombinantsed DNA molekulid, mida on võimalik paljundada kas siis bakteri või eukarüoodi rakus.

 

 

Tänu täiustunud tehnoloogiale, mis võimaldab üha kiiremini ja odavamalt määrata DNA nukleotiidset järjestust, on paeguseks sekveneeritud paljude organismide genoomi primaarjärjestus (nukleotiidne järjestus). Seisuga jaanuar 2004 (http://www.tigr.org) oli sekveneeritud 133 bakteri, 17 arhe ja 21 eukarüoodi genoom ning sekveneerimisel olevaid genoome on sadu.

 

Genoomide sekveneerimine

 

Inimese genoomi sekveneerimiseks käivitati teadusprojekt, kuhu kaasati laborid erinevatest riikidest. Töö koordineerimiseks loodi rahvusvaheline Inimese Genoomi Organisatsioon HUGO (Human Genome Organization). Esimeseks projekti juhiks oli James Watson, kes koos Francis Crick’iga oli kirjeldanud DNA kaksikhelikaalse struktuuri. 1993-ndast aastast juhib projekti Francis Collins. Töö jaotati erinevate teaduslaborite vahel (põhilised tegijad 8 laborit USA-st ja Sangeri Keskus Inglismaalt).

 

1998. aastal moodustas J. Craig Venter (juhtis enne seda Rockvilli Genoomiuuringute Instituuti Marylandis ja oli seni sekveneerinud mitmete bakterite genoome) firma Celera Inc. Projekti finantseeris Perkin-Elmer korporatsioon. Venter lubas sekveneerida inimese genoomi täielikult kolme aasta jooksul. Võrreldes HGP projektiga olid Venteril kasutada uut tüüpi, võimsamad automaatsekvenaatorid.

 

Konkurents inimese genoomi sekveneerimisel kiirendas ka HGP tegevust. Kogu genoomi DNA järjestuse mustandvariandi valmissaamisest teatati 2000-nda aasta juunis mõlema konkureeriva projekti poolt. Saadud andmete põhjal leiti, et inimesel on vähem geene kui algul arvati – 30000 kuni 40000. Inimese genoom on 3 miljardit aluspaari pikk. Seega on valku kodeerivaid järjestusi ligikaudse hinnangu alusel 1-2% genoomist. 2003. a. aprilliks, DNA kaksikheeliksi kirjeldamise 50-ndal aastapäevaks, esitas HGP inimese genoomi nukleotiidse järjestuse, kus 98% geene sisaldavatest aladest oli sekveneeritud 99,99%-lise täpsusega.  

 

Praeguseks on sekveneeritud paljude geneetikas mudelorganismidena kasutatavate organismide genoomid. Nii teame me DNA nukleotiidset järjestust bakteril E. coli, pärmil S. cerevisiae, nematoodil C. elegans, äädikakärbsel, hiirel, taimedest müürloogal Arabidopsis thaliana. 2004. a. aprillis teatati roti genoomi DNA järjestuse määramisest.

 

Genoomi primaarjärjestuse teadasaamine aitab oluliselt kaasa genoomi funktsioonide uurimisele. Mis funktsioon on ühel või teisel DNA järjestusel, selgub geneetilistest katsetest sama järjestuse mutantidega. Viimastel aastatel leiavad üha enam rakendust ka uued molekulaarsed meetodid, millest põgusalt tuleb juttu allpool.  

 

Globaalne geeniekspressiooni uurimine

 

Teades genoomi terviklikku järjestust, on võimalik uurida organismi kõigi või paljude geenide avaldumist korraga. Valmistatud on nn. geenikiibid (gene chips), kus seotakse kandjale (näiteks nailonmembraanile või klaasile) fikseeritud asukohtadesse DNA lõigud, mis pärinevad organismi erinevatest geenidest. Viimastel aastatel on paralleelselt geenikiipidega hakatud inglise keeles kasutama ka termininit microarray. Rakkudest eraldatakse kogu mRNA ja hübridiseeritakse sellest valmistatud prooviga kandjale kinnitatud DNA-d. Hübridisatsioonisignaalid skanneeritakse ja nende tugevust analüüsitakse arvutis. Tugevamad signaalid saadakse nendele DNA lõikudele, millele vastavat RNA-d on rakus rohkem (mida tugevamalt geen avaldub, seda enam sünteesitakse vastavalt geenijärjestuselt RNA-d) ja nõrgemad nendele, millele vastavat RNA-d on vähem. Nii on võimalik uurida samaaegselt paljude geenide avaldumismäära rakus. Samuti on võimalik kiiresti testida seda, kas uuritav indiviid põeb mõnda geneetilist haigust (geneetilise haiguse puhul on muutunud teatava geeni või mitmete geenide avaldumistase rakus) või on organism nakatunud viirusega, näiteks HIV-ga. 

 

Geenikiibid organismi paljude või kõigi geenide ekspressiooni uurimiseks on saadaval sekveneeritud genoomiga organismide puhul.

 

Kaasaegse geneetika rakendusalad

 

Geneetikaalased uuringud on väga suures ulatuses suunatud meditsiinile. Need uuringud on võimaldanud täpsemalt mõista päritavate haiguste biokeemilist olemust ning isoleerida geneetilisi haigusi põhjustavaid geene. Nii on näiteks isoleeritud mutantsed geenid, mis põhjustavad tsüstilist fibroosi, Dushenne’i lihasdüstroofiat, Huntingtoni tõbe, fragiilse X sündroomi, Alzheimeri tõbe, rinnavähki. 

 

Ka meie käitumine ning isiksuse omadused on väga suures ulatuses geneetiliselt määratud. Väga palju on seda uuritud ühemunakaksikute puhul. Näiteks alkoholism, skisofreenia, ning maniakaalne depressiivsus on geneetilise eelsoodumusega. See tähendab, et vastavaid mutantseid geene kandvatel isikutel on võrreldes teistega risk haigestuda suurem. Ka homoseksuaalsus on geneetiliselt determineeritud.

 

Molekulaargeneetika meetodeid on hakatud kasutama kohtumeditsiinis isikute tuvastamiseks. Piisab väikesest veretilgast või juuksekarvast, et sealt in vitro paljundada huvipakkuvaid DNA segmente edaspidiseks DNA järjestuse analüüsiks. Inimpopulatsioon on geneetiliselt heterogeenne, mis tähendab seda, et DNA nukleotiidses järjestuses on indiviiditi erinevusi. Neid erinevusi on võimalik tuvastada molekulaarsete meetoditega.

 

Elavat diskussiooni on tekitanud geneetiliselt manipuleeritud köögiviljade kasvatamine. Näiteks sel teel saadud tomatid sisaldavad geeni, mis võimaldab tomatil kauem säilida. Osa inimesi, esskätt “roheliste” liikumises osalejad näevad geneetilises manipuleerimises ohtu ning püüavad seda igati takistada. Nende liikumine on suunatud ka katseloomade kaitsele, mis mõnikord võtab äärmusliku vormi. Näiteks on vabastatud ja linna lahti lastud laborites peetud rotte ja teisi katseloomi.

 

Geneetika ja meditsiin

 

Haiguste geneetilisele determineeritusele vihjas juba 20-nda sajandi algul Garrod, kes juhtis tähelepanu sellele, et alkaptonuuria on levinud perekonniti. Seda haigust põhjustab homogentisiinhappe akumuleerumine organismi. Akumuleerumise käigus oksüdeerub see ühend tumedaks produktiks ning koguneb silmadesse, nina piirkonda ja mujale kudedesse. Ka haigete uriin muutub õhu käes tumedaks. Garrod märkas, et see haigus pärandub Mendeli seaduspärasuste järgi.

 

Haigusi põhjustavate geenide isoleerimine on töömahukas protsess. Haigust põhjustab teatav geen sel juhul, kui tema nukleotiidses järjestuses on tekkinud muutus – mutatsioon, mille tagajärjel muutub kas geeni avaldumismäär (suureneb, väheneb või muutub geen inaktiivseks ja rakus ei sünteesita enam selle geeni poolt kodeeritud valku) või funktsioon (mutantne geen kodeerib muutunud omadustega valku) Näiteks Huntingtoni tõbe (surmaga lõppev neuroloogiline haigus) põhjustav geen isoleeriti 1993-ndal aastal, kuid sellele eelnes 10-aastane intensiivne uurimisperiood. Nii fragiilset X (tugev vaimne alaareng) kui ka Huntingtoni tõbe põhjustavate mutatsioonide uurimisel selgus, et muutus seisneb kolmenukleotiidilise DNA järjestuse kordistumises, mis mõjutab geeni avaldumist.

 

Geeniteraapia (geenidefekti kompenseeritakse normaalse, funktsionaalse geeni viimisega haige indiviidi rakkudesse)  muutub võimalikuks alles siis, kui konkreetsed haigusttekitavad geenid on isoleeeritud ning osatakse defineerida nende geenide poolt kodeeritud valkude biokeemilisi funktsioone organismis. Tsüstilise fibroosi (soolade transport rakkudest sisse ja välja on häiritud, kopsud, pankreas ja maks eritavad lima, mis soodustab nende organite infektsiooni ning haiged surevad sageli näiteks kopsupõletikku) põhjustab mutatsioon transmembraanset valku CFTR kodeerivas geenis, mis moodustab epiteelkudede rakkudes ioonkanaleid. Tsüstilise fibroosi puhul on püütud rakendada ka geeniteraapiat, nakatades inimese hingamisteede epiteelrakke modifitseeritud adenoviirusega, mille genoomi on viidud normaalne CFTR geen. Sel viisil on mõnikord saavutatud osalist paranemist, kuid see metoodika ei võimalda töödelda kahjustatud piirkondi teistes organites.

 

Molekulaarse diagnostika meetoditega on võimalik inimorganismist tuvastada haigust tekitavaid mutantseid geene. See aitab otsustada, millist ravi ja hooldust patsient vajab. Eriti oluline on sünnieelne diagnostika, mida rakendatakse eeskätt siis, kui vanemate suguvõsas on kirjeldatud geneetilisi haigusi. Väärarengute ning enamasti surmaga lõppevate haiguste puhul saavad siis vanemad otsustada, kas lasta sellisel lapsel sündida.

 

Ka vähk on sisuliselt geneetiline haigus. Rakkude jagunemist ja diferentseerimist kontrollivad paljud erinevad geenid. Kui mõni nendest geenidest on muteerunud või nende regulatsioon on muutunud, võivad rakud asuda kontrollimatult jagunema ning põhjustada kasvajate arengut. Neid raku jagunemist kontrollivaid geene võivad kahjustada mutatsioonid, mis akumuleeruvad somaatilistesse rakkudesse inimese eluajal ning selle tagajärjel muutuvad normaalsed rakud vähirakkudeks. Mõnede vähktõbede puhul on ka päritav eelsoodumus. Sel juhul päranduvad mutantsed geenid sugurakkude kaudu järglastele. Näiteks rinnavähi puhul on leitud kaks mutantset geeni, BRCA1 ja BRCA2, mis levivad perekonniti. Risk haigestuda on sel juhul 10 korda suurem.

 

 

Geneetika osa kaasaegses põllumajanduses

 

Kuigi aretustöö teadlik läbiviimine, toetudes geneetika põhitõdedele, algas 20-ndal sajandil, on aretustööga tegeldud juba läbi aegade. Esimesed nisusordid, mis erinesid looduslikest, on 7000 kuni 10000 aastat vanad. Sordiaretuse teel on saadud näiteks hübriidne mais, mille saagikus on võrreldes algsega tõusnud ligi 250%. Nisu puhul on aretatud stressikindlamaid sorte, mis on sobivad kasvatamiseks just paljudes kohtades arengumaades. Palju aretustööd on tehtud tomatitega, mille tulemusena varieeruvad viljad nii suuruselt, värvuselt kui ka kujult. Koduloomade tõuaretuse teel on püütud saada näiteks suurema piima- või lihatoodanguga loomi. Tänu kunstlikule seemendamisele saab ühe häid järglasi andva isase spermat koguda ja külmutada, et seda jätkuks tuhandeteks viljastamiseks. 

 

Transgeensed organismid

 

Transgeensetel taimede ja loomade konstrueerimisel on 3 põhilist eesmärki::

1.        Soovitavate tunnuste lisamine või võimendamine kultuurtaimedel ja koduloomadel.

2.        Huvipakkuva produkti tootmine taimes või loomas.

3.        Transgeensete organismide konstrueerimine eesmärgiga uurida bioloogiliste protsesside toimumise molekulaarseid mehhanisme.

 

Taimi on püütud muuta ka resistentsemaks kahjuritele. Bakteri Bacillus thuringiensis genoomis on geen, mis kodeerib putukatele toksilist valku. Vastav geen on viidud tomatitaimede genoomi ning selle avaldumist taimes on näidatud võrdluskatsetega, kus geneetiliselt muudetud taimed on võrreldes algsetega kahjurite suhtes vastupanuvõimelisemad. Geenitehnoloogiat on rakendatud ka maisi sordiaretuses.

 

Organismi kloonimine

 

Viimasel aastatel on asutud katsetama loomade kloonimisega, kus somaatilise raku geneetiline materjal viiakse munarakku, millest on eelnevalt eemaldatud munarakus olev geneetiline materjal. Jagunema stimuleeritud munarakust arenevad isendid, kes on geneetiliselt identsed doonoriga. 1997-nda aastal tekitas palju diskussiooni kloonitud lamba Dolly sündimine. Täiskasvanud lamba udarast isoleeritud rakke kultiveeriti laboritingimustes. Teiselt utelt isoleeriti munarakud, millest kõrvaldati tuum. Seejärel liideti tuumata munarakud koekultuuris kasvatatud diploidsete piimanäärme rakkudega ning implanteeriti asendusemale, kelleks oli kolmas utt. Sündis lammas, kes oli geneetiliselt identne udararakkude doonoriga. Praeguseks on lisaks lambale kloonitud veel hiiri, rotte, veiseid, kitsi, sigu, küülikuid ja hobuseid. Primaatide kloonimine on osutunud tehniliselt keerukamaks. Inimese kloonimine on paljudes riikides seadusega keelatud. Siiski on tehtud katseid ka inimesega, eesmärgiga saada embrüonaalseid tüvirakke. Tüvirakke on võimalik suunata diferentseeruma erinevateks rakutüüpideks, mida saaks kasutada selliste haiguste raviks, kus teatud rakud organismis on kaotanud oma funktsiooni (näiteks südamelihase kärbumine, neurodegeneratiivsed haigused jne.). 2004. aasta märtsis teatasid Lõuna-Korea teadlased ajakirjas „Science“ inimese kloonimisest. Kloonitud embrüoid lasti areneda vaid väga varajase, blastotsüsti staadiumini. Seejärel katse peatati. Osadest blastotsüstidest õnnestus saada ka embrüonaalsete tüvirakkude liin.     

 

 

Geneetika valekasutused

 

Darwini loodusliku valiku ideed, mille alusel organismidele kahjulikud tunnused asendatakse evolutsiooni käigus kasulikemaga, leidsid edasiarendust Francis Galtoni poolt. Galton arvas, et ka inimese vaimsed ja füüsilised tunnused on päritavad ning neile rakendub valik. Et inimsugu parandada, soovitas Galton rakendada kunstlikku valikut. Ta võttis kasutusele mõiste eugeenika, mille mõte seisnes selle, et heade tunnustega vanematel tuleb soodustada järglaste saamist, kehvade tunnustega vanematel aga takistada. Eelistud tunnused olid näiteks kõrge intelligentsus, loomingulisus, tugev tervis, kõrvaldatavad aga madal intelligentsus, vaimsed haigused, kriminaalne käitumine ja alkoholism. Eugeenikat on 20-nda sajandi esimesel poolel rakendatud paljudes maades. USA-s steriliseeriti näiteks indiviidid, keda peeti idiootideks või kriminaalideks. Pooltes osariikides oli seadusega ette nähtud steriliseerida ka alkohoolikud, epileptikud ning väära seksuaalse orientatsiooniga indiviidid. Euroopas rakendati steriliseerimist suhteliselt kaua näiteks Põhjamaades.

 

Eugeenikat rakendati 20-nda sajandi esimesel poolel ka migratsioonipoliitikas. Näiteks USA-s eelistati 20-ndatel aastatel sisserändajaid Põhja-Euroopast, seati aga piiranguid neile, kes tulid Vahemere äärest, Hiinast ja Kesk-Euroopast. Üks kõige julmemaid eugeenika rakendusi oli juutide, mustlaste ja teiste rahvaste massiline hävitamine natsistliku Saksamaa poolt.

 

Kartuses sattuda eugeenikutega ühe mütsi alla, hoidusid paljud geneetikud inimese geneetikaga tegelemisest. Nüüdseks on ajad muutunud. Praeguses Lääne ühiskonnas kutsuks eugeenikaalaste ideede propageerimine esile tugeva vastureaktsiooni. Neis riikides on inimeste elukvaliteet oluliselt paranenud. Varem tegid juba raskemad elutingimused oma korrektiivi, viletsamad lihtsalt surid. Tänu meditsiini ja hoolekande süsteemide täiustamisele on ühiskonnal võimalik ka geneetiliste haigustega indiviide ülal pidada.

 

Geneetikaalaste põhitõdede eiramine muutus riiklikuks doktriiniks Nõukogude Liidus seoses lõssenkismi tekkega. Lõssenko tegeles taimede sordiaretusega ning tuli välja seisukohaga, mille järgi toimuvad soovitud muutused taimesortides keskkonnatingimuste toimel. Need ideed meeldisid väga Stalinile, kes leidis, et see mõttekäik sobib hästi kokku marksistliku ühiskonnateooriaga, mis väitis, et ühiskondlik kord mõjutab inimese omaduste arengut. Klassikaline geneetika kuulutati ebateaduseks ning Mendeli õpetuse pooldajad sattusid vanglasse, kus nad sageli ka surid. Kuigi Lõssenko tõed olid väärad ja neil ei olnud rakenduslikku väärtust, nõuti positiivseid tulemusi ja nii olid mõnedki sunnitud oma elu päästmise või karjääri nimel andmeid võltsima. Geneetika areng Nõukogude Liidus seiskus pikaks ajaks.


<tagasi 

2. Reproduktsioon kui pärilikkuse alus

 

Rakk kui elusorganismi ehituskivi

 

Vastavalt rakutüübile jagunevad elusorganismid prokarüootideks ja eukarüootideks. Prokarüoodid e. eeltuumsed on üherakulised organismid (näiteks bakterid), kellel pole rakutuuma. Nende tsütoplasmat ümbritseb rakumembraan ning peptidoglükaanist koosnev rakukest. Puuduvad rakuorganellid. DNA on koondunud ühte regiooni, mida nimetatakse nukleoidiks. Bakteriraku paljunemistsükkel on väga lühike. Soodsas kasvukeskkonnas võib rakk jaguneda iga 20 minuti tagant. Seega võib ühe raku järglaskond 11 tunni jooksul kasvada 5 miljardini, lähenedes kogu meie planeeti asustavate inimeste rahvaarvule. Bakterid on kõige iidsem eluvorm Maal ning nad on kohastunud eluks väga erinevates keskkonnatingimustes.

 

Eukarüootne rakk on võrreldes prokarüootse rakuga tunduvalt suurem ning komplekssem. Lisaks tuumale, kus paikneb DNA, sisaldab ta erinevaid membraanseid ja mittemembraanseid rakuorganelle. Rakku ümbritseb plasmamembraan. Taimerakul on ka rakukest, mis sisaldab tselluloosi. Membraanseoselised valgud on sageli glükoproteiinid, sest nad on seotud sahhariididega. Membraanseoselisi valke, mis interakteeruvad rakuväliste molekulidega ning annavad signaali edasi raku sisemusse, nimetatakse retseptoriteks. Mutatsioonid geenides, mis kodeerivad retseptoreid, võivad põhjustada näiteks haigestumist vähki.

 

Eukarüootsed organismid on enamasti multitsellulaarsed ning nende rakkude ehitus ja funktsioon on erinevates kudedes erinev. Raku üldstruktuur on kõigil juhtudel siiski sama. Membraaniga ümbritsetud tuumas paikneb raku DNA ning seal toimub ka RNA süntees. Sünteesitud RNA molekulid transporditakse tsütoplasmasse läbi tuumapooride. Tsütoplasma sisaldab torujaid membraane, mis moodustavad võrgustiku, mida nimetatakse endoplasmaatiliseks retiikulumiks (ER). Osa ER-st on karedapinnaline, kuna seal paiknevad ribosoomid ning seal toimub valgusüntees. Sünteesitud valgud transporditakse läbi ER membraani ning viiakse raku erinevatesse piirkondadesse, kus neid vajatakse. Ribosoomidest vaba ER-i nimetatakse siledaks ER-ks ning seal toimub näiteks teatavate hormoonide süntees. Golgi kompleksis, mis koosneb samuti membraansetest struktuuridest, säilitatakse ning sageli modifitseeritakse sünteesitud valke. Näiteks insuliin sünteesitakse esmalt proinsuliinina, mis seejärel Golgi kompleksis lõigatakse funktsionaalseks insuliiniks. Päritavad defektid Golgi kompleksis toimuva proinsuliini protsessingu suhtes põhjustavad vastava mutatsiooni kandjatel diabeeti. Golgi kompleksis toimub ka näiteks süsivesikute süntees.

 

Mõnikord liituvad Golgi kompleksi vesiikulid plasmamembraaniga ja väljutavad enda sisu rakku ümbritsevasse keskkonda. Seda protsessi nimetatakse eksotsütoosiks. Golgi kompleksist eralduvad vesiikulid, mida nimetatakse lüsosoomideks, moodustavad membraaniga ümbritsetud kotikesi, mis sisaldavad ensüüme, mis on võimelised lagundama kõikvõimalikke rakus leiduvaid molekule. Mutatsioonid geenides, mis kodeerivad lüsosoomides asuvaid ensüüme, võivad põhjustada erinevaid kaasasündinud haigusi. Näiteks Tay-Sachs tõve korral on defektne lüsosüümides paiknev ensüüm, mis vastutab gangliosiidi degradatsiooni eest. Seda lipiidset molekuli leidub hulgaliselt närvirakkude membraanis. Kui gangliosiidi degradatsioonirada on blokeeritud, koguneb vaheühend, mis on ajurakkudele toksiline ning hävitab aju funktsioonid. Haiged lapsed surevad väga varakult, tavaliselt enne kolmeaastaseks saamist. Lüsosoomidele funktsionaalselt sarnased on peroksisoomid. Peroksisoomid sisaldavad ensüüme, mis kasutavad orgaaniliste molekulide oksüdeerimiseks molekulaarset hapnikku. Osa neist ensüümidest toodavad keemiliste reaktsioonidega vesinikperoksiidi, mis on väga tugev oksüdeerija, teised jälle lagundavad seda.

 

Taimerakkudes paiknevad membraaniga ümbritsetud kotikesed, mida nimetatakse vakuoolideks. Nad võivad võtta enda alla kuni 90% kogu rakusisesest ruumalast. Vakuoolid võivad sisaldada erinevaid lahustunud sooli või sahhariide, toksilisi jääkprodukte ja pigmente, mis osalevad taime õite ja lehtede värvuse kujundamisel. Vakuoolid aitavad taimerakkudel tagada kõrget siserõhku.

 

Mitokondrid ja kloroplastid on arenenud prokarüootsetest rakkudest, mis on kunagi sattunud suurema raku sisse. Neil organellidel on oma geneetiline materjal, mis sageli esineb DNA rõngasmolekulina nagu seda on ka bakterite kromosoom. Paljud mitokondrite ja kloroplastide valgud on nende endi poolt kodeeritud. Mitokondrid on rakkude “jõujaamad”, sest neis toimub energia konverteerimine lipiididest ja süsivesikutest adenosiin trifosfaadiks ATP. Energeetiliselt aktiivsemates rakkudes on mitokondreid rohkem. Mitokondritel on kaks membraani. Sisemisel membraanil asuvad ensüümid, mis on seotud energia konverteerimisega. Selleks, et suurendada sisemembraani pinda, on ta sisse sopistunud, moodustades harju e. kriste (cristae). Mutatsioonid mitokondrite geenides võivad põhjustada päritavaid haigusi nagu näiteks silmahaigus, mida tuntakse kui Leberi päritavat optilist neuropaatiat (LHON). Ka vananemist seostatakse mutatsioonidega mitokondriaalses DNA-s.

 

Kloroplaste leidub ainult taimerakkudes ning neis toimub fotosüntees. Ka kloroplastidel on topeltmembraan. Kloroplastide sisemuses paiknevad membraansed kettad, mida nimetatakse tülakoidideks. Tülakoidid paiknevad kloroplastide keskosas, mida nimetatakse stroomaks. Tülakoidides asub valgust siduv pigment klorofüll.

 

Eukarüootsele rakule on iseloomulik ka tsütoskelett. See koosneb valgukiududest, mis annavad rakkudele kuju, võimaldavad neil liikuda ning osalevad rakusiseses organellide paigutuses. Põhiliselt esinevad tsütoskeleti komponendid mikrofilamentidena ja mikrotuubulitena. Defektid raku tsütoskeletis on jällegi seotud geneetiliste haigustega. Näiteks Duchenne’i lihaseline düstroofia on põhjustatud mutatsioonidest geenis, mis kodeerib raku tsütoskeletis osalevat valku düstrofiin.

 

Lühiülevaade kromosoomidest

 

Rakkude jagunemisel on oluline, et geneetiline materjal jaotuks võrdselt mõlemasse tütarrakku. Geneetiline materjal on organiseerunud struktuuridesse, mida nimetatakse kromosoomideks. Prokarüootse raku genoomiks on üks kaksikahelaline DNA molekul, mis on tavaliselt rõngasmolekul. Eukarüootidel on rohkem kui üks kromosoom. Mõnedel liikidel on erinevate kromosoomide arv isegi üle saja. Iga kromosoom koosneb lineaarsest DNA molekulist, mis on valkudega väga tihedalt kokku pakitud. Inimese  kromosoomi DNA kontuurpikkus varieerub 2,5 kuni 5 cm vahel. Kõikide inimese kromosoomide DNA kogupikkus ulatub üle meetri. Jagunevates rakkudes on DNA kromosoomides eriti tihedalt kokku pakitud, kondenseerunud, ning iga kromosoom on valgusmikroskoobiga vaadeldes eristatav. Mittejagunevates rakkudes on DNA kokkupakituse aste väiksem ning kromosoomid ei ole üksteisest eristatavad. Jagunevates rakkudes on näha kromosoomide struktuursed iseärasused. Replitseerunud kromosoom koosneb kahest tütarkromatiidist, mis on teineteisega ühinenud tsentromeeri kaudu. Tsentromeeri asukoht on erinevatel kromosoomidel erinev, paiknedes kas kromosoomi keskel või ühes otsas. Kromosoomide liikumise eest vastaspoolustele raku jagunemise käigus vastutab tsentromeeris asuv kinetohoor.

 

Kromosoomide replikatsiooni ja tütarrakkudesse jaotumise seisukohalt on olulised teatavad elemendid DNA järjestuses. Mitmed DNA piirkonnad, DNA replikatsiooni alguspunkid, sisaldavad signaale DNA replikatsiooni initsiatsiooniks. Erinevalt bakteri kromosoomist algab eukarüootse kromosoomi replikatsioon paljudest kohtadest korraga. Tsentromeeri moodustaval DNA järjestusel on kaks erinevat funktsiooni – nende järjestuste kaudu on pärast DNA replikatsiooni omavahel ühendatud tütarkromatiidid ning sinna kinnituvad ka valgud, mis viivad tütarkromatiidid jaguneva  raku vastaspoolustele. Kromosoomide otstes on telomeersed DNA järjestused, mis vastutavad selle eest, et replitseeruks kogu kromosoomi DNA. Iga kromosoomi puhul on tegemist individuaalse lineaarse DNA molekuliga.

 

Rakutsükkel

 

Rakutsükli moodustab jada sündmusi, mille käigus toimub perioodiline DNA replikatsioon ning replitseerunud DNA jaotumine tütarrakkudesse. Eukarüootse raku rakutsüklis eristatakse nelja faasi – G1, S, G2 ja M. Kahte G faasi nimetatakse vahefaasideks (“gaps”), S faasis toimub DNA süntees ning M faasi ajal raku jagunemine. Imetaja rakkude puhul, mida on kasvatatud koekultuuris, kestab rakutsükkel umbes 24 tundi. G1 faas kestab 10 tundi ning sel ajal toimub rakus normaalne metabolism, rakk kasvab suuremaks, temas sisalduvate organellide arv kahekordistub ja toimub ettevalmistus DNA replikatsiooniks. S faas algab DNA replikatsiooniga ning kestab ligikaudu 9 tundi. S faasi lõpuks koosnevad kromosoomid kahest tütarkromatiidist. Kui replikatsioon on lõppenud, läheb rakk faasi G2, mis kestab neli tundi. Selles faasis jätkub raku kasvamine ja ta valmistub mitoosiks. Mitoos (M faas) e. raku jagunemine kestab ligikaudu tunni. Selle käigus liiguvad tütarkromatiidid jaguneva raku vastaspoolustele. Teineteisest eraldunud tütarrakud on geneetiliselt identsed.

 

Rakutsükli toimumine on eukarüootidel väga täpselt kontrollitud protsess. Üleminek ühest tsükli faasist teise toimub rakuväliste ja rakusiseste keemiliste signaalide koostoimel. Rakutsüklis eristatakse mitmeid kontrollpunkte (checking points). Sisenemine igasse järgmisesse faasi vajab kindlaid signaale. Neid signaale võtavad vastu valgud, mida nimetatakse tsükliinideks ning valgud, mis komplekseeruvad tsükliinidega – tsükliinidest sõltuvad kinaasid CDK (cyclin-dependent-kinases). CDK valgud fosforüleerivad  teisi valke, reguleerides sel teel nende valkude aktiivsust ja funktsioone. Üks kõige tähtsamaid rakutsükli kontrollpunkte START paikneb G1 faasi keskel. See kontrollpunkt on reguleeritud D tüüpi tsükliinide ja CDK4 poolt. Kui kontrollpunktis toimub vajalike signaalide rakule edastatamine tsükliin-CDK kompleksi poolt, valmistub rakk minema S faasi. Raku sisenemist S faasi võivad takistada veel hilises G1 faasis saadud negatiivsed signaalid nagu DNA kahjustused või toitainete vähesus. Neid signaale annavad edasi inhibiitorvalgud, pärssides tsükliin-CDK kompleksi toimimist rakus.

 

Vähirakkude puhul on sageli leitud, et tsükliin-CDK kompleksid on kaotanud reguleeritavuse mutatsioonide tõttu geenides, mis kodeerivad tsükliine või CDK valke. Kui näiteks kontrollpunkt START ei ole õigesti reguleeritav, muutuvad kontrollimatuks rakkude kasv ja jagunemine. Mitmete tuumorite puhul on kirjeldatud just selle kontrollpunkti regulatsiooni häireid. Normaalse rakutsükli regulatsiooni korral rakutsükkel DNA kahjustuste korral peatub, kuni DNA reparatsioonisüsteem need kahjustused kõrvaldab või kui kahjustusi ei suudeta parandada, siis läheb rakk apoptoosi ja sureb. Kui kontrollpunkt ei reageeri õigesti, võib DNA replikatsioon toimuda ka siis, kui DNA-s on kahjustusi. Selle tulemusena suureneb rakus mutatsioonide hulk, millest osa võivad põhjustada vähki.

 

Prokarüoodi genoom on haploidne, koosnedes ainult ühest kromosoomist, mis on tavaliselt DNA rõngasmolekul. Erinevalt eukarüootsest rakutsüklist ei ole prokarüootne rakutsükkel nii rangelt reguleeritud. Kiiresti kasvavas rakupopulatsioonis võivad bakterirakud jaguneda iga 20 – 30 minuti tagant. Kuna juba ainuüksi bakteri genoomi replikatsioon kestab ligikaudu 40 minutit, on rakutsükli erinevad etapid kattuvad. Samas bakterirakus võib olla erinevatel ajaetappidel algatatud kuni kolm DNA replikatsioonitsüklit, nii et samal ajal kui replitseerunud tütarkromosoomid teineteisest eralduvad ja toimub raku pooldumine, toimub neilt juba omakorda replikatsioon. 

 

 

Raku jagunemine mitoosi teel

 

Eukarüootne rakk võib jaguneda nii mitoosi kui ka meioosi teel. Mitoosi teel jagunenud tütarrakud on emarakuga geneetiliselt identsed. Nii emarakk kui ka tütarrakud on diploidsed (2n), mis tähendab seda, et iga kromosoomitüüp on esindatud kahes korduses, homoloogiliste kromosoomide paaridena. Rakkude meioosi teel jagunemisel moodustuvad sugurakud, mis on oma kromosoomselt koostiselt haploidsed (n), sisaldades kõigist homoloogiliste kromosoomide paaridest ainult ühte kromosoomi.

 

Mitoosi kirjeldas esimesena 1879-ndal aastal Walter Flemming. Mitoosiprotsess on pidev, kuid selle käsitlemise hõlbustamiseks on ta jagatud viieks erinevaks faasiks. Interfaas hõlmab kõik rakutsükli faasid, mis jäävad raku jagunemisfaaside vahele (faasid G1, S ja G2). Raku jagunemisel eristatakse nelja faasi – profaas, metafaas, anafaas ja telofaas. Igale faasile on iseloomulik teatav kromosoomide struktuur ja “käitumine”. Profaas ja telofaas on teistest pikemad. Esimesed märgid varsti algavast mitoosist on jälgitavad interfaasi rakkude tsütoplasmas paikneva tsentrosoomi duplitseerumise näol. Tsentrosoomi külge kinnituvad mitoosi ajal mikrotuubulitest moodustunud kääviniidid, mis veavad tütarkromatiidid jaguneva raku vastaspoolustele.

 

Varajane profaas algab siis, kui duplitseerunud tsentrosoomid liiguvad raku vastaspoolte suunas. Nende vahele moodustuvad mikrotuubulitest kiud (mitoosikääv). Kromosoomid on veel väljavenitatud, kuid algab nende kondenseerumine ja muutumine diskreetseteks ühikuteks. Hilises profaasis on kromosoomid kõrgelt kondenseerunud. Iga kromosoomi kaks tütarkromatiidi on tsentromeeride kaudu ühendatud. Tsentromeeridega kompleksseeruvad kinetohoorid, mille külge kinnituvad hiljem kromosoomide liikumises osalevad mikrotuubulid. Tsentrosoomid on nüüd liikunud raku vastaspoolustele. Tuumamembraan fragmenteerub ja kaob ning toimub mikrotuubulite kinnitumine tsentromeeridele.

 

Metafaasis jäävad kondenseerunud tütarkromatiidide paarid kokku ning jaotuvad raku pooluste vahele jäävale ekvatoriaaltasapinnale. Metafaasi kromosoomid on tsütoloogiliselt kõige paremini jälgitavad. Igal kromosoomil on temale ainuomane struktuur. Metafaasikromosoomide analüüsil on võimalik tuvastada kromosoomide kahjustusi ning muutusi kromosoomide arvus. Selliste muutuste kirjeldamine aitab diagnoosida kromosoomidefektidest põhjustatud haigusi.

 

Anafaasis eralduvad tütarkromatiidide tsentromeerid ning tütarkromatiidid liiguvad raku vastaspoolustele. Nende liikumine toimub mikrotuubulite lühenemise tulemusena. Iga kromatiidi võib nüüd käsitleda iseseisva kromosoomina. Anafaasi kromosoomid on võrreldes metafaaasi kromosoomidega mõnevõrra pikenenud.

 

Telofaasis on kromosoomid liikumise lõpetanud ja mikrotuubulid jaotuvad laiali. Raku vastaspoolustele liikunud kromosoomide ümber tekib tuumamembraan. Kromosoomid dekondenseeruvad. Seejärel toimub tsütokinees ja rakk jaguneb pooleks. Loomarakkudel toimub see rakumembraani sissesoondumise teel, taimerakkudel moodustub tütarrakkude vahele tselluloosi sisaldav rakuplaat, mille pooled teineteisest eemale tõukuvad.

Sõltuvalt organismist ja rakkude keskkonnast võib mitoos kesta mõnest tunnist mitme päevani.  

 

Raku jagunemine meioosi teel

 

Neli aastat pärast seda, kui oli esmakirjeldatud mitoosi, märkas Edouard van Beneden, et ümarussi Ascaris munarakkudes on kromosoome võrreldes somaatiliste rakkudega poole vähem. Liigile iselomulik kromosoomide arv taastus pärast munaraku viljastamist. Ta nimetas sellist rakujagunemist, kus kromosoomide arv väheneb poole võrra, meioosiks (vähendav jagunemine). Ta arvas ekslikult, et kõik emalt saadud kromosoomid liiguvad ühte tütarrakku ja isalt saadud teise. Tegelikult toimub homoloogiliste kromosoomide jaotumine tütarrakkude vahel juhuslikult. Kuigi meioosiprotsessi oli väga täpselt kirjeldatud juba 19-nda sajandi lõpul, ei osatud seda tol ajal veel pärilikkusega seostada. 

 

Meioosis toimub kaks rakujagunemist. Esimene jagunemine (meioos I) on komplekssem ning seda nimetatakse ka redutseerivaks jagunemiseks (reduction division). Selle jagunemise käigus homoloogilised kromosoomid paarduvad (konjugeeruvad) omavahel ning lahknevad seejärel juhuslikkuse alusel tütarrakkudese. Meioosi teisel jagunemisel (meioos II), mida nimetatakse ka võrdväärseks jagunemiseks (equational division) jaotuvad tütarrakkudesse tütarkromatiidid nii, nagu see toimub ka mitoosis.

 

Esimese meioosi profaas on pikk ja kompleksne ning on selle täpsemaks kirjeldamiseks jagatud viieks erinevaks staadiumiks. Leptonema käigus ilmuvad kromosoomid nähtavale. Zügonema staadiumis toimub homoloogiliste kromosoomide paardumine, mille käigus moodustuvad tetraadid, sest iga kromosoom koosneb kahest tütarkromatiidist. Samas ei ole tütarkromatiidid üksteisest veel eristatavad. Homoloogide kromatiidide vahel toimub DNA segmentide vahetus ristsiirde (crossing over) teel. Homoloogiliste kromosoomide kromatiidide vahel tekivad sünapsid. Jätkub ka kromosoomide kondenseerumine. Kolmandas staadiumis, mida nimetatakse pachynema, on näha, et iga kromosoom koosneb kahest tütarkromatiidist. Jätkub kromosoomide kondenseerumine. Diplonema staadiumis tõukuvad homoloogilised kromosoomid üksteisest eemale, kuid jäävad ühendatuks kiasmide kaudu. Diplonema staadium (kasutusel on ka sünonüüm diploteen) võib osade loomade ja ka inimese puhul kesta aastaid. Inimesel moodustub lootestaadiumis umbes 400000 küpsemata munarakku, ootsüüti, mille jagunemine peatub just selles staadiumis. Alles menstruatsioonitsükli käigus valmib kord kuus üks munarakk, läbides poolelijäänud meioosi. Mida kauem on meioos peatunud, seda suurem on oht, et kromosoomide jaotumises tütarrakkudesse võib olla vigu. Nii näiteks suureneb naistel vanemas eas risk sünnitada Downi sündroomiga laps, mida põhjustab 21 kromosoomi trisoomia. Profaasi viimases staadiumis diakineesis lühenevad kromosoomid veelgi ning tuumamembraan hakkab kaduma.

 

Esimeses metafaasis on kromosoomid tugevalt kondenseerunud ning homoloogiliste kromosoomide paarid asuvad raku ekvatoriaaltasapinnal. Nende tsentromeeride regiooni on seostunud mikrotuubulid ning homoloogiliste kromosoomide otste vahel on jälgitavad veel kiasmid.

 

Esimeses anafaasis liiguvad homoloogilised kromosoomid raku vastaspoolustele. Tütarkromatiidid jäävad omavahel tsentromeeride kaudu ühendatuks! Seega koosneb iga kromosoom ikka veel kahest tütarkromatiidist.

 

Järgneb telofaas, kus kromosoomid on jõudnud raku vastaspoolustele ning nende ümber moodustub tuumamembraan. Tütarrakkude tuumad on haploidsed, sisaldades kõigist homoloogiliste kromosoomide paaridest ühte kromosoomi. Lühikese interfaasi käigus DNA replikatsiooni ei toimu. Osade organismide puhul algab meioosi teine etapp vahetult pärast telofaasi ning interfaasi etapp jääb vahele.

 

Meioosi teine etapp meenutab mitoosi ainsa erandiga selles, et kromosoomide arv on poole väiksem. Anafaasis lahknevad tütarkromatiidid raku erinevatele poolustele.

 

Meioosi häired

 

Meioosi käigus võib esineda vigu kromosoomide jaotumises tütarrakkudesse. Selle tulemusena võib seemne- või munarakku sattuda mõni kromosoom topelt või jääb mõni kromosoom puudu. Kromosoomide ebavõrdset jaotumist meioosi teel esineb küllalt sageli ka normaalsete meeste seemnerakkude puhul – kuni 5% seemnerakkudest sisaldavad ebanormaalset kromosoomide komplekti. Kromosoomide normaalset lahknemist võivad mõjutada mitmesugused keskkonnategurid, näiteks röntgenkiirgus, kemikaalid. Olulist rolli mängib ka indiviidi vanus. Näiteks 20-aastastel naistel on risk saada Downi sündroomiga laps 4:10000, kuid 45-aastastel on see võimalus suurenenud 50 korda (200:10000). Samas esineb ealine sõltuvus ka meeste puhul – ligi 20% ebanormaalse kromosoomide arvuga lapsi sünnib kromosoomide ebavõrdse jaotumise tõttu vanemate meeste seemnerakkudes. Suguvõsade uuringutest on ilmnenud, et osades suguvõsa liinides esineb meioosi häireid sagedamini kui teistes. See viitab sellele, et nende indiviidide puhul on normaalne meioos häiritud mutatsioonide tõttu geenides, mis vastutavad homoloogiliste kromosoomide vahel toimuva geneetilise rekombinatsiooni või tsentromeeridele mikrotuubulite kinnitumise eest.

 

Meioosi evolutsiooniline tähtsus

 

Esimeses meioosis toimub homoloogiliste kromosoomide juhuslik lahknemine tütarrakkudesse. Inimesel on 23 paari kromosoome. Iga kromosoomipaari puhul on 50%-line tõenäosus, et gameeti satub emalt päritud kromosoom. Tõenäosus, et ühte gameeti satuvad kõik emalt päritud kromosoomid, on äärmiselt väike – (1/2)23. Seega on kromosoomide võimalike kombinatsioonide arv 223. Geneetilist muutlikkust aitab suurendada veel meioosi esimeses profaasis toimuv geneetiline rekombinatsioon (ristsiire) homoloogiliste kromosoomide kromatiidide vahel.

 

 

Gameetide moodustumine erinevatel organismidel

 

Haploidsete rakkude tekkimist meioosi teel ning nende küpsemist funktsionaalseteks sugurakkudeks (gameetideks) nimetatakse gametogeneesiks.

 

Munarakkude moodustumine oogeneesi teel

 

Embrüonaalse arengu varajases staadiumis diferentseeruvad rakud erinevateks tüüpideks, millest ühe tüübi puhul moodustuvad hiljem meioosi teel sugurakud. Oogeneesis tekib kahe meioosi teel jagunemise tulemusena ainult üks küps munarakk. Algul korduvalt mitoosi teel jagunenud rakkudest arenevad primaarsed ootsüüdid. Meioosi esimesel jagunemisel pooldub rakk ebavõrdselt: enamus tsütoplasmast satub sekundaarsesse ootsüüti ning teine tütarrakk, mida nimetatakse esimeseks polaarkehaks, on oluliselt väiksem ning hävib hiljem. Sekundaarse ootsüüdi jagunemisel teise meioosi käigus on tsütoplasma jaotumine jällegi ebavõrdne - tekib munarakk, mis sisaldab enamuse tütoplasmast ning väike polaarkeha.  Kui munarakk naisel ei viljastu, ta degenereerub.

 

Spermatogenees

 

Kui munarakud on organismi kõige suuremad rakud, siis seemnerakud vastupidi on kõige väiksemad. Suuruse erinevus on tingitud nende rakkude erinevatest funktsioonidest. Munarakk on suhteliselt liikumatu ning sisaldab hulgaliselt varuaineid, mis on vajalikud embrüo varajaseks arenguks. Seemnerakk on see-eest väga liikuv ning koosneb peamiselt haploidsest tuumast ja sabast. Puuduvad endoplasmaatiline retiikulum, Golgi aparaat ja ribosoomid. Vähesed mitokondrid on kogunenud sabasse, kus nad toodavad energiat saba liikumiseks. Seemneraku peas on lisaks tuumale vesiikulid, mis sisaldavad ensüüme, mis aitavad seemnerakul läbida munaraku seina.

 

Spermatogenees algab meestel puberteedieas ning toimub seejärel pidevalt. Meioosieelsed rakud jagunevad mitoosi teel kuni diferentseeruvad primaarseteks spermatotsüütideks. Primaarsed spermatotsüüdid läbivad esimese meioosi, mille tulemusena moodustuvad sekundaarsed spermatotsüüdid. Pärast teist meiootilist jagunemist on igast primaarsest spermatotsüüdist moodustunud neli haploidset spermatiidi. Spermatiidid diferentseeruvad küpseteks seemnerakkudeks spermatozoidideks. Arenevad seemnerakud jäävad meioosi käigus üksteisega  tsütoplasma sildade kaudu ühendatuks seni, kuni neist arenevad spermatozoidid. Spermatogeneesi käigus kaotavad rakud tsütoplasmat.

 

Munaraku viljastamisel seondub seemneraku pea munarakku ümbritseva kestaga, mida nimetatakse zona pellucida. See kest sisaldab erinevaid glükoproteiine, mis seonduvad seemnerakuga spetsiifiliselt, eristades sama liigi seemnerakke võõraste liikide seemnerakkudest. Kui seemnerakk on seondunud, vabanevad vesiikulitest ensüümid, mis aitavad tal munaraku kesta läbida ning soodustavad rakkude membraanide ühinemist. Kohe pärast membraanide ühinemist vabanevad munaraku membraani sisepinnal asunud kortikaalgraanulitest mitmesugused ensüümid ja muud molekulid, mis muudavad zona pellucida struktuuri, et takistada järgmiste seemnerakkude tungimist rakku.

 

Sugurakkude moodustumine taimedel

 

Erinevalt loomadest ei moodustu taimede puhul meioosi käigus kohe sugurakud vaid tekivad spoorid. Enne sugurakkudeks saamist jagunevad haploidsed spoorid korduvalt mitoosi teel, moodustades haploidsetest rakkudest koosnevaid gametofüüte (või tekivad gameete produtseerivad taimed). Haploidsete gameetide liitumisel tekivad diploidsed sügoodid, millest mitoosi teel jagunemise käigus moodustuvad sporofüüdid (või tekivad spoore produtseerivad taimed). Tsükkel kordub, spetsiaalsed rakud sporofüütides jagunevad meioosi teel ja moodustuvad haploidseid spoore. Seega esineb taimede elutsüklis nii haploidne kui ka diploidne faas. Sõltuvalt taime liigist on nende kestvus erinev - madalamate taimede puhul on domineerivaks haploidne faas.

<tagasi

 


3. Mendelism: pärilikkuse üldprintsiibid

 

19. sajandi keskel uuris Brnos (Tsehhimaal) augustiinlaste kloostri munk Gregor Mendel (1822-1884), kes oli ka loodusteadlane ja kooliõpetaja, milliste seaduspärasuste alusel kanduvad organismide tunnused üle järglastele. 1865.a. avaldas ta tulemused, mis panid aluse uue teadusharu – geneetika sünnile. Mendel katsetas erinevate taimedega ja isegi mesilastega, kuid edu saavutas ta siiski eeskätt aedhernestega. Katsed hernestega olid  lõpule viidud juba 1863. aastaks. Mendel kulutas veel paar aastat tulemuste analüüsimiseks, kuid kahjuks ei pälvinud tema artikkel tähelepanu enne kui alles kahekümnenda sajandi alguses.

 

Aastal 1900 otsisid sõltumatult kolm botaanikut Hugo de Vries Hollandist, Carl Correns Saksamaalt ning Eric von Tschermak-Seysenegg Austriast, kas on ka varem publitseeritud andmeid, mis kinnitaksid nende endi katsetulemusi pärilikkuseteoorias ja leidsid, et Gregor Mendel oli samad seaduspärasused kirjeldanud juba 35 aastat tagasi. Nüüd levisid Mendeli ideed kiiresti ja seda eeskätt tänu inglise bioloogi William Batesoni aktiivsele tutvustustööle. Pärilikkuseteaduse asemel võeti kasutusele uus termin geneetika (tuleneb kr.  keelsest sõnast tähendusega “tekitama”).

 

Mendeli objekt aedhernes Pisum sativum

 

Mendeli edu tulenes õnnestunud objekti valikust. Aedherne eripäraks on see, et tema õite kroonlehed on allapoole tihedalt suletud, vältimaks tolmuterade väljumist ja võõraste sisenemist. Selline süsteem tagab iseviljastumise, kus nii munarakk kui ka seemnerakk pärinevad samast õiest. Erinevalt teistest bioloogidest, kes püüdsid korraga jälgida mitmete väga erinevate tunnuste pärandumise seaduspärasusi, kontsentreerus Mendel vähestele hästieristuvatele parameetritele – taimede pikkus, seemnete värvus.

 

Monohübriidne ristamine: dominantsuse ja lahknemise printsiip

 

Mendel ristas kõrgekasvulisi hernetaimi kääbuskasvulistega. Järglaskond oli kõrgekasvuline sõltumata sellest, kas tolmuterad, mida kasutati viljastamiseks, pärinesid kõrgekasvuliselt hernelt ja tolmendati kääbuskasvulise taime õisi või vastupidi. Kõrgekasvulise järglaskonna puhul toimus iseviljastumine ning järgmises põlvkonnas ilmnes tunnuste lahknemine. 1064-st järglasest 787 olid kõrgekasvulised ja 277 kääbused, lahknemissuhe oli ligikaudu 3:1. Mendel märkas, et kääbuskasv võib hübriidides esineda latentsena, olla varjutatud faktori poolt, mis määrab taimede kõrge kasvu. Latentne faktor oli retsessiivne ja avalduv faktor dominantne. Mendel järeldas, et hübriidsete taimede järglaskonnas pidi olema toimunud dominantse ja retsessiivse faktori lahknemine. Kuidas teisiti oleks võimalik seletada kääbuskasvuliste järglaste ilmumist.

 

Mendel kordas katseid aedhernega ka teiste tunnuste pärandumise seaduspärasuste uurimiseks. Ta viis läbi seeria monohübriidseid ristamisi erinevate vastandlike tunnuste suhtes, jälgides seemnete tekstuuri, värvust, kaunade kuju ja värvust, õite värvust ja asukohta. Kõigil juhtudel avaldus hübriidsete taimede tunnuste puhul üks vastandlikest omadustest ning hübriidide iseviljastumise tulemusena saadud järglaskonnas toimus faktorite lahknemine suhtega 3:1. Hiljem, 1909. aastal võttis Taani taimearetaja W. Johannsen nende faktorite asemel kasutusele termini geen, mille retsessiivseid ja dominantseid vorme hakati nimetama alleelideks (kr. keeles “üks teisest”).                

 

Mendel tegi oma katsetulemustest ka teise olulise järelduse: geenid esinevad paaridena. Taimed, mida ta kasutas ristamiseks, sisaldasid kahte identset geenikoopiat. Kaasaegse terminoloogia kohaselt olid need taimed diploidsed ja homosügootsed. Gameetides säilis aga ainult üks geenikoopia, need rakud olid kaasaegse terminoloogia põhjal haploidsed. Geenide diploidsus taastus sügoodi moodustumisel. Kui munarakk ja seemnerakk pärinesid geneetiliselt erinevatelt taimedelt, sisaldas sügoot kahte erinevat alleeli, millest üks pärines isalt ja teine emalt. Selline järglaskond oli heterosügootne.

 

Selleks, et tähistada pärilikkusefaktoreid, kasutas Mendel sümboleid. Geneetiliste sümbolite kasutamise kõige üldisemad printsiibid on tänapäevani säilinud. Näiteks taimede kasvu mõjutavaid alleele märgitakse järgmiselt: d – kääbuskasv (d pärineb inglise keelsest sõnast “dwarfness”, kääbuskasv); D - dominantne kõrget kasvu määrav alleel. Üldiselt lähtutaksegi sellest, et alleeli tähistus tuleneb retsessiivsest tunnusest. Seega märgitakse kõrgekasvuliste ja kääbuskasvuliste taimede alleelset koostist e. genotüüpi vastavalt DD ja dd. Tunnuste ilmetüüpi, antud juhul siis kõrget või kääbuskasvu, nimetatakse isendite fenotüübiks.

 

Ristamises osalenud vanemaid (inglise keeles “parents”) tähistatakse tähega P – P generatsioon. Nende hübriidset järglaskonda tähistatakse F1. F1 põlvkond on genotüübilt Dd ja fenotüübilt kõrgekasvuline nagu DD genotüübiga vanematel. F1 järglased produtseerivad kahte tüüpi gameete – D  ja d genotüübiga, alleelid D ja d lahknevad e. segregeeruvad teineteisest sõltumata. Iseviljastumise tagajärjel liituvad gameedid erinevates kombinatsioonides, produtseerides nelja tüüpi sügoote: DD, Dd, dD ja dd. Munarakust pärinev alleel märgitakse tavaliselt esimesena. Kuna D on dominantne alleel, siis on kolme esimese genotüübi puhul järglaskond ühesuguse fenotüübiga – kõrgekasvuline. Ainult genotüübi dd korral avaldub kääbuskasv. Seega on iseviljastumise teel saadud järgmine generatsioon F2 kas kõrgekasvuline või kääbuskasvuline lahknemissuhtega 3:1. Alleelide segregeerumise bioloogiliseks aluseks on homoloogiliste kromosoomide paardumine ja sellele järgnev lahknemine tütarrakkudesse meioosiprotsessis.

 

 

 

Seega kehtivad Mendeli  poolt teostatud monohübriidsetel ristamistel kaks printsiipi:

 

1.        Dominantsuse printsiip – heterosügootides esineb üks alleelidest varjatud kujul.

2.        Segregeerumise printsiip – kaks erinevat alleeli segregeeruvad heterosügootide gameetide moodustumisel.

 

Neid kahte printsiipi tuntakse ka Mendeli I ja II seadusena:

 

Mendeli I seadus e. ühetaolisuse seadus – Erinevate homosügootsete isendite ristamisel on esimese põlvkonna järglased F1 kõik ühetaolised heterosügoodid sõltumata ristamise suunast.

 

Mendeli II seadus e. lahknemisseadus – Heterosügootide (hübriidide) järglaskonnas toimub geneetiline lahknemine, nii et kindlates sagedussuhetes tekivad nii homosügootsed kui ka heterosügootsed isendid.

 

Dihübriidne ristamine: sõltumatu lahknemise seadus e. vaba kombineerumise seadus (Mendeli III seadus)

 

Mendel viis läbi ka selliseid ristamisi, kus taimed erinesid teineteisest rohkem kui ühe tunnuse osas. Ta ristas kollaste ja ümmarguste seemnetega herneid roheliste ja kortsus seemnetega hernestega. Katse eesmärgiks oli kontrollida, kas kaks tunnust, seemnete värvus ja tekstuur päranduvad sõltumatult. Kuna F1 põlvkonna taimede seemned olid kollased ja ümmargused, olid vastavad alleelid dominantsed. F1 põlvkonnas ilmnesid neli erinevat fenotüüpi: vanematega sarnased kollased ja ümmargused ning rohelised ja kortsulised ja kaks uut kombinatsiooni – rohelised ja ümmargused ning kollased ja kortsulised. Seega olid värvus ja tekstuur kontrollitud erinevate geenide poolt, mis kandusid järglaskonda sõltumatult. Toimus ka mõlemate geenide alleelide lahknemine. Sellist kahe tunnuse suhtes jälgitavat ristamist nimetatakse dihübriidseks ristamiseks. Alleelide tähised tuletati retsessiivsetest omadustest: g – “green”; w – “wrinkled”. Kasutades sümboleid, näeb vastav ristamise skeem välja järgmine:

 

 

  

 

Vanemad                P                              kollased, ümmargused                         rohelised, kortsulised

                                                                                                                                X

                                                                                GG WW                                                                  gg ww

 

                                                Gameedid                   G W                                                                       g w

 

                                F1                                                                   kollased, ümmargused

 

                                                                                                                  Gg Ww

 

                                                Gameedid                               GW          Gw          gW          gw

 

 

                                                                                                                Iseviljastumine

 

                                F2                                                                            4 erinevat fenotüüpi, 9 genotüüpi

                                                                                                                                kollased, ümmargused         9/16

                                                                                                                                kollased, kortsulised              3/16

                                                                                                                                rohelised, ümmargused        3/16

                                                                                                                                rohelised, kortsulised            1/16

 

 

Erinevad alleelipaarid segregeeruvad, kombineeruvad üksteisest sõltumatult.

Vt. Viikmaa leksikon!

 

 

Mendeli seaduste kasutamine inimese geneetikas

 

Mendeli seadusi hakati laiemalt kasutama varsti pärast nende uuesti avastamist käesoleva sajandi algul. Inimese pärilikkuse geneetilise analüüsi aluseks on informatsioon, mis on saadud sugupuude uurimisest. Põhilised raskused seisnevad selles, et järglaskond on väike, sugupuud sageli ebatäielikult koostatud, alati pole kirjas õige isa. Oluline on ka ajafaktor - mõned haigused ilmnevad alles keskeas. Sellegipoolest on tänaseks geneetiliselt iseloomustatud palju erinevaid haigusi ning indiviidide väliseid tunnuseid. Mõned näited: dominantsed tunnused on kääbuskasv, brahhüdaktüülia (lühikesed sõrmed), Huntingtoni tõbi (neuroloogiline defekt), lokkis juuksed. Retsessiivsed tunnused on albinism (pigmendi puudumine), alkaptonuuria, tsüstiline fibroos, Duchenne lihasdüstroofia, fenüülketonuuria, sirprakne aneemia.

 

Sugupuud on diagrammid, mis näitavad perekonnas olevaid sugulusastmeid. Meessoost indiviide tähistatakse ruutudega ja naissoost indiviide ringidega. Ringi ja ruutu ühendav horisontaalne joon näitab ühist järglaste saamist. Järglased näidatakse pealt ühendatud joonega, esmasündinu on kõige vasakpoolsem. Need indiviidid, kellel avaldub uuritav omadus, näidatakse värvitud või viirutatud sümbolitega. Põlvkonnad on tavaliselt tähistatud rooma numbritega.

 

Tavaliselt avalduvad dominantsed alleelid ka järgmistes põlvkondades. Dominantne alleel võib ilmuda perekonda ka mutatsiooni tagajärjel, kuid selle sündmuse tõenäosus on väga harv – üks miljonist. Need dominantsed tunnused, mis vähendavad fertiilsust ja elujõulisust, on populatsioonis väga harvad. Seega on selliseid tunnuseid kandvad inimesed enamasti vastava alleeli suhtes heterosügootsed.     

 

Retsessiivseid tunnuseid on märksa raskem identifitseerida, sest vanematel ei pruugi need avalduda. Siiski on praeguseks kirjeldatud üle 4000 retsessiivse tunnuse. Retsessiivsed tunnused avalduvad sagedamini siis, kui vanemad on omavahel suguluses.

 

Mendeli seadusi on võimalik kasutada arvutamaks, millise tõenäosusega sünnib vanematel haige laps. Näiteks on mõlemad vanemad heterosügootsed retsessiivse alleeli suhtes, mis põhjustab tsüstilist fibroosi. Kui perekonda sünnib 4 last, on võimalikud 5 erinevat varianti: kõik lapsed on normaalsed, 1 on haige, 2 on haiged, 3 last 4-st on haiged ning kõik lapsed on haiged. Loogiline oleks arvata, et kõige tõenäolisemalt realiseerub variant 3 normaalset ja 1 haige laps. Konkreetse sünni puhul on ¾ tõenäosusega laps normaalne. Tõenäosus, et kõik lapsed oleksid normaalsed, on seega ¾ x ¾ x ¾ x ¾ = (¾)4 = 81/256. Võimalus, et 1 konkreetne laps sünnib haigena, on ¼. Seega tõenäosus, et kõik lapsed sünniksid tsüstilise fibroosiga, on (¼)4 = 1/256. Tõenäosus, et 3 last on normaalsed ja 1 haige, arvutatakse järgmiselt. Sõltuvalt haige lapse sünnijärjekorrast on 4 erinevat võimalust: NNNA, NNAN, NANN, ANNN, kus N = normaalne, A = haige. Iga võimalus realiseerub tõenäosusega (3/4)3 x ¼. Tõenäosus, et 1 laps 4-st sünnib haigena hoolimata laste sünnijärjekorrast on 4 korda suurem, 4 x  (3/4)3 x ¼. Tõenäosus, et 2 lastest sünnivad tervena ja 2 haigusega, on 6 x (3/4)2 x (1/4)2, sest sel juhul on laste sünnijärjekorda arvestades 6 erinevat võimalust.

 

 

<tagasi

4. Mendelismi edasiarendus

 

Alleelne varieeruvus ja geeni funktsioon

 

Mendeli õpetuse järgi on igal konkreetsel geenil 2 alleeli – üks dominantne ja teine retsessiivne. Edasised uuringud on aga näitasid, et geenil võib olla rohkem kui 2 alternatiivset varianti e. alleeli, ning iga alleel mõjutab fenotüüpi erinevalt.

 

Semidominantsus ja kodominantsus

 

Alleel on dominantne siis, kui tal on samasugune fenotüübiline efekt nii homosügootses kui ka heterosügootses olekus, st. Aa ja AA on fenotüübiliselt eristamatud. Mõnel juhul on heterosügootide fenotüüp homosügootide fenotüübist erinev. Näiteks lõvilõua õied on valged, kui taim on homosügootne retsessiivse alleeli suhtes (ww) ja punased, kui taim on homosügootne dominantse alleeli suhtes (WW). Heterosügootsed taimed (Ww) on aga roosade õitega. Alleel W annab õitele punase värvuse, alleeli w puhul aga pigmenti ei toodeta. Pigmendi intensiivsus õie kroonlehtedes sõltub geeni doosist: homosügoodis WW on geeni produkti (punast pigmenti) 2 korda enam kui heterosügoodis Ww. Sellest ka roosad õied. Osaliselt dominantset alleeli, mis avaldub heterosügootides nõrgemini, nimetatakse ka semidominantseks alleeliks.

 

Inimese vererakud võivad toota 2 erinevat produkti – N ja M antigeeni. Neid antigeene toodavad sama geeni 2 alleelset varianti. Alleeli M suhtes homosügoodid toodavad ainult M antigeeni, alleeli N suhtes homosügoodid aga ainult N antigeeni. Heterosügootides üks alleel teist maha ei suru, vaid avalduvad mõlemad ning seetõttu on verest testitavad nii M kui ka N antigeen. Sel juhul on alleelid kodominantsed. Kuna kodominantsuse puhul avalduvad alleelid teineteisest sõltumatult, märgitakse mõlemad alleelid suurte tähtedega ja üleval indeksina. Seega on M ja N alleelide tähistused LM ja LN. Täht L tuleneb konkreetsel juhul erinevate veretühmade avastaja Karl Landsteineri nimest.

 

Mitmealleelsus

 

Klassikaline näide mitmealleelsusest esineb küülikute karvavärvust määrava geeni c puhul. Sellel geenil on 4 erinevat alleeli: c – albiino (c tuleneb inglisekeelsest sõnast “colorness”, värvusetu), ch – himaalaja, cch – chinchilla ja c+ – metsiktüüp. Homosügootses olekus on igal alleelil kindel toime karva värvusele. cc küülikud on üleni valge karvaga, chch küülikud on valged mustade kõrvade, käppade ja ninaotsaga, cch cch küülikud on valgete karvadega, millel on mustad otsad ja c+ c+ küülikud on tumedakarvalised. Kuna enamus looduslikus populatsioonis elavaid küülikuid on tumedakarvalised, siis kutsutakse c+ alleeli metsiktüüpi alleeliks. + märk on geneetikutel metsiktüübi tähiseks. Geene nimetatakse sageli mutantse alleeli järgi ja enamasti just selle alleeli järgi, mille efekt on kõige markantsem (antud juhul valge karvavärvus).

 

Mitmealleelsusega on seotud ka inimese AB0 vererühmade süsteem. Geenil, mis produtseerib kas A või B antigeeni, on 3 alleelset vormi: IA, IB ja I0. IA kodeerib A antigeeni, IB kodeerib B antigeeni ja I0 alleel ei määra midagi. 6 võimalikule genotüübile vastavad 4 fenotüüpi: A veregrupile (IAIA või IAI0), B veregrupile (IBIB või IBI0), AB veregrupile (IAIB) ja 0 veregrupile (I0I0). Alleelid IA ja IB on kodominantsed, kuid  I0 on mõlema suhtes retsessivne. Kuna kõik geeni I 3 erinevat alleeli esinevad arvetatava sagedusega inimpopulatsioonis, nimetatakse seda geeni polümorfseks (kreekakeelsest sõnast, mis tähendab “omab palju vorme”).

 

Alleelide seeriad

 

Erinevate alleelide kombineerumisel võivad alleelid omada erinevat efekti sõltuvalt sellest, milline alleel millisega on kombineerunud. Küüliku karvavärvust määravate alleelide vahel valitseb domineerumises hierarhia c+ > cch > ch > c. Lahtiseletatult tähendab see seda, et metsiktüüpi alleel on täielikult funktsionaalne, chinchilla ja himaalaja alleelid võimaldavad produtseerida pigmenti vaid osaliselt ning albiino üldsegi mitte. Erinevad alleelide kombinatsioonid heterosügootidel viivad erinevatele fenotüüpidele. Kõik metsiktüüpi alleeli omavad isendid on fenotüübilt tumedakarvalised, cchc heterosügoot hele chinchilla, cchch alleelidega küülik hele chinchilla mustade kõrvade, käppade ja ninaga ning chc heterosügoot on fenotüübilt himaalaja. Alleelide seeriates nimetatakse mittefunktsionaalseid alleele null või amorfseteks alleelideks. Osaliselt funktsionaalsed alleelid on hüpomorfsed, nad on retsessiivsed nende alleelide suhtes, mille funktsioon neid varjutab (tavaliselt metsiktüüpi alleel).

 

Mutatsioonide testimine alleelsuse määramiseks

 

Seda, kas mutantne fenotüüp on põhjustatud sama geeni alleelse teisendi poolt või mitte, saab testida näiteks testertüvega ristamise teel. Sellist analüüsi saab läbi viia retsessiivsete mutatsioonide uurimiseks. Ristamisse võetav testertüvi on homosügootne teatava geeni retsessiivse alleeli suhtes. Juhul, kui ka järglaskonnal avaldub mutantne fenotüüp, on mutantne alleel sama geeni variant, mille alleel on testertüvel retsessiivne. Näiteks äädikakärbsel Drosophila melanogaster on kirjeldatud 2 retsessiivset mutatsiooni – cinnabar ja scarlet, mis mõlemad põhjustavad kärbestel erepunast silmavärvi. Metsiktüüpi kärbestel on tumedad silmad. Selleks, et teha kindlaks, kas cinnabar ja scarlet mutatsioonid on toimunud samas geenis, st., kas tegemist on sama geeni alleelidega, ristati mutantseid kärbseid omavahel. Kuna järglased olid fenotüübilt metsiktüüpi, viitas see sellele, et mutatsioonid olid toimunud erinevates geenides, ristamise käigus toimus komplementatsioon mutantsete geenide suhtes. Kui testiti kolmandat mutatsiooni cinnabar-2, ristates mutantseid kärbseid cinnabar ja scarlet mutantidega, saadi mutantsed järglased cinnabar kärbestega ristates ja metsiktüüpi järglased scarlet mutatsiooni kandvate kärbestega ristates. Need tulemused näitavad, et cinnabar-2 ja cinnabar on ühe ja sama geeni alleelid.   

 

Sel viisil ei saa testida dominantseid mutatsioone, sest dominantne alleel avaldub nii või teisiti, hoolimata sellest, millist mutatsiooni kannab ristamisse võetav testertüvi.

 

Mutatsioonide toime organismile võib olla erinev

 

Mutatsioonid, mis muudavad mõnda morfoloogilist tunnust, näiteks seemnete värvust või tekstuuri, on nähtavad mutatsioonid. Enamus neist on retsessiivse toimega.

 

Mutatsioone, mis takistavad organismi reproduktsioonivõimet, nimetatakse steriilseteks mutatsioonideks. Mõned steriilsed mutatsioonid mõjutavad mõlemat sugupoolt, mõned on aga spetsiifilised kindlale soole. Toime soojätkamisele võib olla kas täielikult või ainult osaliselt pärssiv.

 

Mutatsioonid, mis kahjustavad organismi elulisi funktsioone, on letaalsed mutatsioonid. Nende fenotüübiline avaldumine väljendub isendi surmas ning seda enamasti juba looteeas. Enamus geene võivad muteeruda nii, et mutatsiooni toime on organismile letaalne. Dominantsed letaalsed mutatsioonid kõrvalduvad ühe põlvkonna vältel, sest kõik järglased surevad. Retsessiivsed mutatsioonid võivad püsida populatsioonis kaua, kuna heterosügootides on nad alla surutud metsiktüüpi alleelide poolt. Retsessiivseid letaalseid mutatsioone on võimalik tuvastada siis, kui järglaskonnas toimub fenotüüpide osas ebatavaline lahknemine. Näiteks mutatsioon yellow-lethal (kollane-letaalne) Yl on hiirtel dominantne nähtav, kuna seda alleeli kandvatel hiirtel on karv hallikaspruuni asemel kollane. Samas on ta ka retsessiivne letaalne, kuna kahte seda alleeli kandvad järglased surevad juba embrüostaadiumis. Kuna värvuse seisukohalt on mutatsiooniga alleel dominantne, võiks heterosügootide ristamisel oodata järglaskonnas lahknemist suhtega 3 kollast:1 hallikaspruun. Tegelikult on see suhe aga 2:1, sest YlYl homosügoote ei sünni.

 

Geeni produkt on polüpeptiid

 

Polüpeptiidid on makromolekulid, mis koosnevad aminohapetest. Igas organismis sünteesitakse tuhandeid erinevaid polüpeptiide, mis erinevad üksteisest aminohappeliselt järjestuselt. Polüpeptiidid on aluseks valkudele. Valke, mis katalüüsivad biokeemilisi reaktsioone, nimetatakse ensüümideks. Osa valke on raku struktuurseteks komponentideks, samuti on transpordifunktsioonidega valke. Beadle ja Tatum  postuleerisid, et iga geen vastutab konkreetse polüpeptiidi sünteesi eest. Kui geenis on mutatsioon, siis vastavat polüpeptiidi kas ei sünteesita või on sünteesiprodukt muutunud funktsioonidega. Need muutused kajastuvad ka fenotüübilistes muutustes.

 

Mis määrab selle, et osa mutatsioone on dominantsed, osa aga retsessiivsed?

 

Retsessiivsete mutatsioonide tagajärjel kaotab geen oma funktsiooni, mis viib selleni, et vastavat polüpeptiidi enam ei sünteesita või on sünteesitud polüpeptiid mittefunktsionaalne. Seega on retsessiivsete mutatsioonide puhul tegemist funktsiooni kaotanud alleelidega. Dominantse mutatsiooni puhul sünteesitakse aga polüpeptiid, mis käitub võrreldes algse polüpeptiidiga teisiti. Seetõttu nimetatakse dominantseid mutatsioone sisaldavaid alleele neomorfseteks, uue funktsiooni omandanud alleelideks. Dominantsete mutatsioonide näiteks võib tuua mutatsiooni hiire T geenis. Heterosügootses olekus põhjustab see mutatsioon hiire saba lühenemist, homosügootsed järglased hukkuvad aga juba embrüostaadiumis. T geen kodeerib 436 aminohappe pikkust polüpeptiidi, mis on võimeline seonduma DNA-ga ja reguleerima hiire normaalseks arenguks vajalike geenide avaldumist. Mutantse geeni produkt on lühem ja muutunud struktuuriga ning häirib heterosügootides normaalse valgu seondumist DNA-ga, muutes arenevas lootes geenide avaldumise taset. Seetõttu ongi mutantset alleeli kandvad hiired lühema sabaga. Kahte dominantset alleeli kandvates homosügootides on aga paljude arengubioloogiliselt oluliste geenide avaldumine häiritud, mistõttu järglasi ei sünni. Siinkohal tasub siiski märkida, et paljud dominantsed mutatsioonid võivad olla seotud just funktsiooni kadumisega.

 

Geenide fenotüübilist avaldumist mõjutavad tegurid

 

Keskkonna mõju geenide avaldumisele

 

Sama geeni erinevate alleelide poolt kodeeritud produktid võivad olla erineva temperatuuritundlikkusega. Näiteks mutatsiooni shibire kandvad äädikakärbsed on elujõulised ja sigimisvõimelised 25°C juures, kuid paralüseeruvad ootamatu shoki, näiteks raputamise tagajärjel (shibire tuleneb jaapanikeelsest sõnast tähendusega “paralüseeruma”). Kui mutantsete kärbeste kultuur viia aga 29°C juurde, paralüseeruvad nad ka ilma raputamata.

 

Keskkonna mõju inimese geenidele

 

Fenüülketonuuria (PKO) on retsessiivne haigus, kus on häiritud aminohapete metabolism. Sellise kahjustusega homosügootsetel lastel puudub fenüülalaniini hüdroksülaas, mis muudab fenüülalaniini türosiiniks. PKO haigetel kogunevad fenüülalaniin ja selle derivaadid organismi ning häirivad närvirakkude arengut, mistõttu sellised lapsed on vaimsete puuetega. Kuna PKO patsientidel on türosiini tase organismis normaalsest madalam, on neil melaniini sünteesitase madalam ning seetõttu ka nõrgem pigmentatsioon. Euroopa rahvastel on keskmiselt üks haigusjuht 10000 sünni kohta. PKO-d saab ravida dieediga, kus fenüülalaniini kogus on võrreldes tavalise toiduga tunduvalt madalam. Kui imikul on tuvastatud PKO ja tema toitmisel peetakse kinni dieedist, kasvab vaimselt normaalne laps.

 

Ka bioloogiline keskkond, näiteks indiviidi sugu, võib mõjutada geenide avaldumistaset. Näiteks kiilaspäisus areneb nii heterosügootsetel kui ka homosügootsetel meestel, homosügootsetel naistel on see tavaliselt seotud aga üksnes juuste hõrenemisega. Vastava alleeli avaldumise käivitab testosteroon, mille kogus on mehe organismis märksa kõrgem.

 

Penetrantsus ja ekspressiivsus

 

Penetrantsus on sagedus protsentides, millega mingi konkreetne genotüüp avaldub selle kandjate fenotüübis. Mittetäieliku penetrantsuse näiteks võib tuua polüdaktüülia, defekti, mille tagajärjel arenevad indiviidil lisasõrmed ja varbad. Kuigi mutatsioon on dominantne, ei avaldu defekt kõigil heterosügootidel. Mittetäielik penetrantsus takistab sugupuude analüüsi. Tavaliselt hinnatakse penetrantsuse kaudu mingi dominantse mutantse alleeli avaldumissagedust heterosügootide hulgas. Penetrantsus sõltub nii indiviidi geneetilisest taustast kui ka elukeskkonnast.

 

Ekspressiivsuse kaudu kirjeldatakse geeni fenotüübilise avaldumise taset. Konkreetne geen võib erinevates indiviidides avalduda erineval tasemel. Enamasti jälgitakse mutantse alleeli avaldumist. Näiteks dominantset lobe mutatsiooni kandvatel äädikakärbestel on silmakuju sagaraline, kuid erinevatel isenditel on sagaralisuse aste erinev. Nii mittetäieliku penetrantsuse kui ka erineva ekspressiivsuse põhjusteks erinevates indiviidides on tunnuste komplekssus, kus konkreetne fenotüüp on seotud kahe või enama geeni avaldumisega. Ka Hapsburgidele iseloomulik etteulatuv alalõug, mis oli levinud Euroopa kuningakodades, on tunnus, mis avaldub erinevatel indiviididel erineval määral.

 

Geenidevaheline interaktsioon

 

Bateson ja Punnett näitasid katseliselt, kuidas 2 erinevat geeni kontrollivad sama tunnust, näiteks geenid R ja P harjakuju kanadel. Wyandottidel (RR pp) on roosikujuline hari, brahmadel (rr PP) aga hernekujuline. F1 hübriidsetel tibudel (Rr Pp) on pähklikujuline hari. Kui neid hübriide ristata omavahel, toimub harjakujus lahknemine 9/19 pähklikujulised (R- P-) , 3/16 roosikujulised (R-pp), 3/16 hernekujulised (rr P-) ning 1/16 harilikud (rr pp). Hariliku harjaga leghornid on mõlema retsessiivse alleeli suhtes homosügootsed.

 

Epistaas

 

Epistaas (tuleneb kreekakeelsest sõnast tähendusega “seisab kõrgemal”) on ühe geeni tõkestav, pärssiv või varjutav toime teise geeni avaldumisele. Need geenid, mida allutatakse, on hüpostaatilised.  Näiteks mutatsioon white on epistaatiline mutatsiooni cinnabar suhtes. Kui äädikakärbsed kannavad mõlemat retsessiivset mutatsiooni homosügootses olekus, on nende silmavärvus ikkagi valge. Selgus, et geen white kodeerib polüpeptiidi, mis transpordib pigmendi kärbse silmarakkudesse. Punast pigmenti sünteesitakse teistes kudedes. Kui vastavat transportvalku ei sünteesita, jäävad kärbeste silmad valgeks.   

 

Valgete (CC pp) ja (cc PP) õitega suhkruherneste ristamisel saadi F1 põlvkonnas purpursete õitega (Cc Pp) järglased, kuid F2 põlvkonnas toimus lahknemine suhtega 9/16 purpursed ning 7/16 valged. Valged olid kõik need, kus vähemalt üks retsessiivsetest alleelidest oli homosügootses olekus. Selgus, et dominantsed alleelid C ja P kodeerivad erinevaid etappe antotsüaani sünteesiks:

 

Geen                                       C                               P

                                Eellane ®  Vaheühend ® Antotsüaan

 

Kui ühte ensüümidest ei produtseerita, on antotsüaani süntees blokeeritud.

 

Kui epistaatilise geeni ainsaks avaldumisviisiks on teise geeni pärssimine, nimetatakse teda inhibiitor- või supressorgeeniks. 

 

Pleiotroopsus

 

Pleiotroopne geen mõjutab samaaegselt erinevaid tunnuseid. Ka eelpoolkirjeldatud fenüülketonuuria sobib näiteks pleiotroopsusele. Mitme tunnuse üheaegne patogeenne muutus on sündroom. Enamasti on pleiotroopsus tingitud ühe geeniprodukti osalemisest erinevates ainevahetusreaktsioonides või erinevate rakutüüpide vahelises kommunikeerumises ja arenguprotsessides.

 

Pideva fenotüübilise varieeruvuse geneetiline baas

 

Sama liigi piires varieeruvad ulatuslikult sellised tunnused nagu organismide kasv, kaal, mille väärtus on määratud paljude geenide ja keskkonna kombineeritud koostoimega. Sellest täpsemalt järgmises peatükis.

 

<tagasi

5. Komplekssete tunnuste päritavus

 

Pärast Mendeli seaduste taasavastamist 20-nda sajandi algul otsisid bioloogid võimalust, kuidas ühendada esialgu vastandlikena näivaid Darwini ja Mendeli vaateid organismide muutlikkusele. Vastavalt Darwini õpetusele on evolutsiooniliste muutuste toimumine pidev, astmeline protsess. Looduslik valik toimib läbi väikeste päritavate muutuste indiviidi tasemel, mis viib järk-järgulistele muutustele populatsiooni tasemel. Silmatorkavad muutused fenotüübis nagu näiteks kääbuskasv või lisasõrmede (varvaste) olemasolu ei oma evolutsioonilises mõttes tähtsust, kuna need elimineeruvad loodusliku valiku toimel populatsioonist kiiresti.

 

Darwini nõbu Francis Galton püüdis tunnuste pidevat muutlikkust kirjeldada, toetudes “gemmulate” (gemmules) kontseptsioonile. Selle järgi määravad tunnuseid geneetilised elemendid, mida Galton nimetas gemmulateks. Mida rohkem gemmulaid osaleb konkreetse tunnuse määramisel, seda enam tunnus varieerub. Näiteks, kui musta ja valget värvust kontrollivad kolm gemmulat, siis on tulemuseks neli erinevat värvuse kombinatsiooni: must (3 musta), tumehall (2 musta, 1 valge), helehall (1 must, 2 valget) ning valge (3 valget). Kui tunnust kontrollivad  6 gemmulat, ilmnevad 7 erinevat fenotüübilist klassi – valge ja must ning nende 5 erinevat varjundit. Seda tüüpi fenotüübilist lahknemist 1:6:15:20:15:6:1 saab kujutada ühtlase kõverana, ja nagu näeme, on vahepealse fenotüübiga isendeid tunduvalt rohkem, kui äärmusliku fenotüübiga.

 

Mendeli seadused kirjeldavad tunnuste vastandlike vormide pärandumist (kui ristata kääbuskasvulisi herneid kõrgekasvuliste hernestega, siis järglased on…). Mendel valis katseteks välja äärmuslikud variandid. Tegelikult on populatsioonis väga erineva kasvuga taimi, samuti varieerub õite värvus ning seemnete tekstuur astmeliselt. Kas on siis üldse võimalik rakendada Mendeli seadusi pideva muutlikkusega tunnuste pärandumisel? Tänu briti geneetiku ja statistiku Ronald Fisheri poolt loodud kvantitatiivsete tunnuste pärandumise mudelile võime öelda, et on küll. Fisheri mudel hõlmab iga geeni individuaalset mõju tunnusele, tunnuse kujunemisel osalevate geenide arvu, geenide ja keskkonna osakaalu tunnuse avaldumisel ning Mendeli lahknemisseadusi. 

 

Mitmealleelsus ning tunnuse pidev muutlikkus.

 

Tunnuse pidev muutlikkus populatsioonis esineb näiteks sel juhul, kui ühel ensüümil esineb mitu vormi, mis kõik erinevad üksteisest ensümaatilise aktiivsuse poolest. Sama geeni erinevate alleelide poolt kodeeritud  ensüüme nimetatakse allosüümideks.  Inimese vererakkudes on kirjeldatud kolme põhilist aluselise fosfataasi ACP varianti, mida määravad kolm alleeli ACPA, ACPB ja ACPC. Nende kolme alleeli kombineerumise tulemusena võivad tekkida kuus erinevat genotüüpi. Aluselise fosfataasi A, B ja C vormid on funktsionaalselt sarnased, kuid erinevad oma liikuvuselt geelelektroforeesil, sest nende aminohappelises järjestuses on erinevusi. Kuue erineva genotüübi puhul on valkude elektroforeetiline pilt erinev. Kõigi kolme homosügootse variandi puhul on geelis elektroforeetiliselt tuvastatavad kaks erinevat, igale tüübile spetsiifilist valgubändi, sest samal polüpeptiidil on kaks konformatsiooni, mis liiguvad geelis erinevalt. Iga erineva genotüübi puhul on ACP aktiivsus erinev, püsides teatavas väärtuste vahemikus. Erinevate genotüüpide korral need väärtused osaliselt kattuvad. Analüüsides ACP aktiivsust kogu populatsioonis saame pideva kõvera, mis näitabki, et selle tunnuse fenotüübiline muutlikkus populatsioonis on pidev.

 

Erinevate lookuste ja keskkonna mõju tunnustele.

 

Päriliku tunnuse pidev muutlikkus on määratud kahe faktori poolt:

1)       kaks ja enam alleelipaari segregeeruvad ning kombineeruvad järglaskonnas üksteisest sõltumatult;

2)       keskkonna mõjutused.

 

Motiveerituna Galtoni uuringutest, avaldas Wilhelm Johannsen aastal 1909 tulemused, kus ta näitas, et tunnuse muutlikkust mõjutab keskkond. Ta leidis, et ubade kaal varieerus 150 kuni 750 mg isegi homosügootsete liinide puhul. Muutlikkus püsis samas ulatuses homosügootses järglaskonnas läbi mitme põlvkonna ka siis, kui uute taimede kasvatamiseks valiti välja kõige suuremad või väiksemad oad.

 

Samal ajal ilmnes Herman Nilsson-Ehle töödest, et sama tunnust võivad mõjutada erinevad geenid. Tunnuse pidevat muutlikkust on võimalik selgitada Mendeli seadusi rakendades. Nilsson-Ehle postuleeris, et nisu terade värvust mõjutavad kolm erinevat geeni. Ristates valgete teradega nisu tumepunaste teradega nisuga sai ta F1 põlvkonnas vahepealset värvi teradega järglased. Nende iseviljastumise tulemusena saadud F2 põlvkonnas toimus aga lahknemine seitsmeks erinevaks fenotüübiks suhtega 1 tumepunane/6 suhteliselt tumepunast/15 punast/20 vahepealset punast/15 helepunast/6 nõrgalt helepunast/1 valge. Seega kontrollisid terade värvust kolm sõltumatult segregeeruvat ja kombineeruvat osaliselt dominantset alleelipaari. Punase pigmendi intensiivsus sõltus sellest, mitu erinevat pigmenti kodeerivat alleeli järglastel oli. Tumepunastel (AA BB CC) kodeerisid kõik 6 alleeli pigmentide sünteesi, valgete (aa bb cc) puhul ei kodeerinud seda aga ei ükski alleel. Vahepealsed värvused avaldusid nende alleelide kombineerumiste tulemusena.

 

Edward East vaatles korraga nii keskkonna kui ka erinevate alleelipaaride sõltumatu lahknemise ja kombineerumise osa järglaskonna pideva fenotüübilise muutlikkuse määramisel. Ta ristas kahte tubakataimede puhasliini (homosügoote), mis erinesid õiekroonide pikkuse poolest. Ühel liinil oli õite keskmine pikkus 41 mm, teisel 93 mm. Mõlema puhasliini puhul esines keskkonnast tingitud muutlikkus. F1 põlvkonnas olid järglased vahepealse pikkusega õitega, kusjuures ilmnes ka keskkonnast tingitud muutlikkus. Järglaste iseviljastumise tulemusena saadud F2 põlvkonnas oli muutlikkus suurem, kuna seda mõjutasid nii keskkond kui ka see, et järglaskond oli genotüübilt heterogeenne. Erinevat tüüpi F2 järglaste iseviljastamisel saadud F3 põlvkonna järglaste fenotüüp varieerus kitsamates piirides, selle keskmine korreleerus F2 põlvkonnast valitud vanemate keskmise fenotüübilise muutlikkusega.

 

Leides F2 põlvkonna lahknemissuhetest vanemate fenotüüpi kordavate isendite osakaalu, on mõnel juhul võimalik määrata, mitu erinevat geeni konkreetset tunnust kontrollivad. Kui 1/64 järglaskonnast omab identset fenotüüpi ühega F1 põlvkonna vanematest, on tegemist kolme geeniga (trihübriidsel ristamisel on vanema genotüüp ühel 64-st järglasest). Just selline suhe ilmnes Nilsson-Ehle’i katsetes. Kui tegemist on nelja sõltumatu alleelipaari lahknemisega, peaks vanemtüüp ilmnema sagedusega 1/256, viie puhul aga sagedusega 1/1024. East analüüsis katsetes tubakataimedega 444 F2 põlvkonna järglast ja ei leidnud sealt ühtegi, kes oleks väliselt identne ühega vanematest. Hiljem selgus, et tubakataimede õite pikkust kontrollivad 9 erinevat alleelipaari. Sellistesse arvutustesse tuleb siiski suhtuda ettevaatlikkusega, sest alati ei ole erinevate geenide mõju fenotüübile võrdne. Samuti võivad osa geene olla omavahel aheldunud. Lisaks tuleb arvestada keskkonna mõju.

 

Resistentsus DDT-le on tunnus, mida kontrollivad mitu geeni.

 

Putukad muutuvad DDT-le resistentseteks. Näiteks toakärbse populatsioonist oli algselt resistentne DDT-le 5%  ning 6 aastat pärast regulaarset DDT-ga kokkupuudet juba 50%. Resistentsust DDT-le põhjustavad neli erinevat mehhanismi:

1)       lipiidse komponendi osakaalu tõus rakkudes võimaldab lipiidides lahustuva DDT lokaalset kontsentratsiooni vähendada;

2)       teatavad ensüümid inaktiveerivad DDT-d efektiivsemalt;

3)       geneetiliselt determineeritud muudatused neuronite membraanides kaitsevad neuroneid DDT toksilise toime eest;

4)       muudatused putukate kitiinkestas vähendavad DDT võimet tungida organismi kudedesse.

 

Kõik need muutused on seotud muutustega genotüübis. Seega osaleb resistentsuse väljakujunemisel väga palju erinevaid geene.

 

 

Alternatiivsete fenotüüpide kompleksne päritavus.

 

Sellised tunnused nagu näiteks resistentsus DDT-le, õisikute pikkus, maisitõlvikute värvus ja ubade suurus on pideva varieeruvusega. Mõnede paljude faktorite poolt samaaegselt kontrollitavate tunnuste avaldumine toimub aga ainult teatavate genotüübiliste variantide korral. Neid tunnuseid nimetatakse lävitunnusteks – ingl. k. “threshold traits”. Näiteks jänesemokale lisandub osadel juhtudel lõhe suulaes, osadel aga mitte. Tunnust määravate geneetiliste variantide rohkus on suur, kuid ainult väheste variantide puhul (alates teatavast geneetilisest lävest) kaasneb lõhestunud huulega lõhe suulaes, ning seda vaid teatavate keskkonna tingimuste korral. Sellist sõltuvust on näidatud ühemuna kaksikute puhul, kes on geneetiliselt identsed. Tunnus avaldub mõlemal kaksikul korraga 40% juhtudest. Kui kirjeldatud fenotüüp oleks määratud ainult geneetiliselt, siis peaks see mõlemal korraga avalduma kõigil juhtudel. Seos päritavusega ilmneb sugupuude analüüsist: esimese astme sugulastel, kes on geneetiliselt lähedasemad, avaldub see tunnus sagedamini kui teise-ja kolmanda astme sugulastel, kes on geneetiliselt heterogeensemad. 

 

Kvantitatiivsete tunnuste analüüs

 

Looduslikes populatsioonides on harva leida diskreetseid (kvalitatiivselt erinevaid) fenotüübilisi klasse. Enamasti täheldame organismide pidevat muutlikkust uuritavate tunnuste osas. Selline muutlikkus on kvantitatiivne. Esimene samm komplekssete tunnuste analüüsimisel ongi katse kirjeldada neid kvantitatiivselt. Et seda teha, võetakse populatsioonist juhuslikud esindajad ning nende analüüsist saadud tulemustest tehakse üldistused suuremale populatsioonile. Arvutatud väärtused on statistilised.

 

Tunnuse kvantitatiivsete väärtuste esinemissageduste jaotuvus (frequency distribution).

 

Andmeid, mis kirjeldavad tunnust kvantitatiivselt, saab esitada graafiliselt, näidates, millise sagedusega teatavad väärtused jaotuvad. Horisontaaltelg, x-telg näitab tunnuse erinevaid väärtusi (näiteks kasvu) populatsiooni erinevate indiviidide korral, vertikaaltelg aga nende väärtuste sagedust.  Jälgiti näiteks nisu küpsemist päevades 40 taime puhul. Vt. õpikust Joonis 5.4 (vanas õpikus 25.9).

 

Keskmine ja modaalklass (The Mean and Modal Class).

 

Valimi keskmine (sample mean) X arvutatakse sel viisil, et summeeritakse kõigi isendite andmed (SXi) ning jagatakse need vaadeldud isendite arvuga n. Joonisel 25.9 on keskmine näidatud kolmnurgaga.

 

                X =  SXi /n

 

Joonisel 25.9 on F1 ja F2 järglaste keskmine terade küpsemise aeg vastavalt 62,20 ja 63,72 päeva. See on veidi lühem aeg kui vanemate keskmistest (55,85 ja 72,47 päeva) arvutatud keskmine (average of the means), mis on 64,16 päeva.

 

Modaalklass on väärtuste klass, kuhu jaotub analüüsitud valimist kõige enam indiviide. Joonisel 25.9 on see näidatud noolega.

 

Valimi varieeruvus ja standardhälve (The Variance and Standard Deviation).

 

Valimi keskmine üksi ei kirjelda seda, kui suures ulatuses andmed keskmisest väärtusest erinevad. Et seda kirjeldada, tuuakse sisse varieeruvuse (variance) mõiste. Varieeruvus mõõdab üksikute andmepunktide hajuvust keskmisest punktist. Valimi varieeruvus s2 (sample variance) arvutatakse valemist

 

                s2 = S(Xi – X)2 / (n – 1)

 

Valimi keskmisest erinemise kirjeldamiseks kasutatakse ka standardhälvet s (standard deviation). Standardhälve on ruutjuur valimi varieeruvusest.

 

                s = Ös2  

 

Üksteisest ulatuslikumalt erinevate andmete puhul on nende varieeruvus ja standardhälve suurem (võrdle näiteks terade küpsemise aega joonisel 25.9 esitatud F2 järglaskonna puhul, mis on genotüübilt heterogeensem võrreldes F1 isendite ja vanematega). Kui vanemad on homosügootsed, siis on erinevused nende puhul tingitud keskkonna mõjudest.

 

Enamasti on kvantitatiivsete tunnuste väärtusi kujutav kõver keskmise väärtuse suhtes sümeetriline. Sellist jaotuvust nimetatakse normaalseks jaotuvuseks (normal distribution).

 

Korrelatsioonikoefitsient.

 

Mõnikord on erinevate omaduste mõõtmistulemuste seeriad omavahel seotud. Näiteks uuritakse populatsioonis kasvu ja kaalu muutlikkust ning soovitakse leida korrelatsiooni nende tunnuste väärtuste suhtes suguluses olevate indiviidide puhul. Tekib küsimus, kas isa ja poegade kaalu vahel esineb seos. Appi võetakse korrelatsioonikoefitsient r.

 

                r =  S[(Xi – X)  (Yi – Y)]/ ((n – 1)sx sy),

 

kus Xi ja Yi on i-nda mõõtmise andmed ning X ja Y valimi keskmised andmed. sx ja sy on vastavalt nende standardhälbed. n näitab valimi suurust. Korrelatsioonikoefitsient varieerub - 1 kuni + 1. Väärtuse – 1 korral on tegemist täielikult negatiivse korrelatsiooniga X ja Y vahel, näiteks pikakasvulistel isadel on lühikesed pojad. Väärtuse + 1 korral on tegemist positiivse korrelatsiooniga  (pikakasvulistel isadel on pikakasvulised pojad). Väärtuse 0 puhul korrelatsioon puudub. Inimestel on nii kasv kui kaal positiivses korrelatsioonis. Samas on kodulindude munade suurus ja nende arv negatiivses korrelatsioonis: kanad munevad näiteks vähem suuri või suuremal arvul väiksemaid mune. Paljude väärtuste vahel aga korrelatsioon puudub (näiteks korrelatsioon indiviidide kasvu ja IQ vahel).

 

Regressioon

 

Isade ja poegade kaal ja kasv on positiivses korrelatsioonis. Samas ei näita korrelatsiooni koefitsient tunnuste väärtusi (näiteks, kui pikk võiks olla poeg teatava kasvuga isa puhul). Appi võetakse regressioonanalüüs. Suhet kahe varieeruvuste seeria (two variables) vahel kirjeldab regressiooni joon (regression line). See matemaatiliselt leitud joon näitab nende seeriate erinevate väärtustega andmete kõige paremat kokkulangevust.   

 

 

Päritavus

 

Fisheri biomeetrilise teooria põhjal on kvantitatiivsed tunnused multifaktoriaalsed – kontrollitud paljude geenide lookuste poolt, mis sisaldavad hulga erinevaid alleele ning keskkonnategurite poolt, mis modifitseerivad genotüübi avaldumist (tunnuse modifikatsiooniline muutlikkus). Tekib küsimus, kui suures ulatuses on populatsioonisisene muutlikkus tingitud indiviidide geneetilisest heterogeensusest ning kui suures ulatuses erinevatest keskkonnatingimustest.

 

Päritavus (heritability) on kvantitatiivse tunnuse populatsioonisisese muutlikkuse see osa, mis on tingitud genotüübilistest erinevustest indiviidide vahel. Ülejäänud osa tunnuse  muutlikkusest on tingitud kas puhtalt eksogeensetest (keskkonna) tingimustest või genotüüpide ja keskkonnategurite vastasmõjust.

 

Multifaktoriaalsed tunnused on näiteks keha suurus, isendi viljakus, organismi vastupanu haigustele, vererõhu tase ja kolesterooli tase organismis.

 

Selleks, et mõõta päritavuse osa tunnuse muutlikkuses, tuleb määrata tunnuse kogu muutlikkus Vt ning leida selles geneetilistest erinevustest tingitud muutlikkuse Vg ja keskkonnateguritest tingitud muutlikkuse Ve osa. Seega,

 

Vt = Vg + Ve  

 

Näiteks on mõõdetud ensüümi A aktiivsust kahe erineva genotüübi ja kahe erineva keskkonna korral (A = 32; 28; 24; 20). Eelpool toodud valemeid kasutades arvutatakse valimi keskmine (= 26) ja varieeruvus s2 (= 26,66) mis kajastab kogu fenotüübilist muutlikkust Vt. Teisel juhul elimineerime keskkonnateguritest põhjustatud erinevused ning arvutame erinevate genotüüpidega isendite ensüümi A aktiivsuste (A = 32; 32; 24; 24) põhjal muutlikkuse Vg (= 21,33). Kolmandal juhul varieerime keskkonnatingimusi identsete genotüüpide korral ja leiame ensüümi A aktiivsuste (A = 32; 32; 28; 28) põhjal Ve (= 5,33).

 

Päritavuskoefitsient.

 

Päritavuskoefitsient h2 väljendab geneetilise muutlikkuse suhteosa Vg tunnuse üldisest populatsioonisisesest muutlikkusest Vt antud keskkonna tingimustes.

 

                h2 = Vg / Vt

 

Eelpooltoodud ensüümiaktiivsuse näite korral on see 21,33 : 26,66 = 0,80

 

Päritavuskoefitsient varieerub nullist üheni. Väärtuse 0 korral ei ole fenotüübiline muutlikkus tingitud genotüübilistest erinevustest, väärtuse 1,0 korral on aga kogu fenotüübiline varieeruvus põhjustatud geneetilistest faktoritest. Päritavuskoefitsient näitab tunnuse geneetilise muutlikkuse osa antud geneetilise struktuuriga populatsioonis konkreetsetes keskkonnatingimustes. See ei näita tunnuse päriliku tingituse määra ega mehhanismi üksikindiviidide arengus.

 

Kunstlik valik.

 

Teades kvantitatiivsete tunnuste päritavuskoefitsienti, on võimalik ennustada kunstliku valiku teel saadud järglaskonna kvantitatiivseid tunnuste omadusi. Kunstlik valik (artficial selection) on eksperimentaatori või aretaja poolt teostatud valik bioloogilistele objektidele eesmärgiga saada teatud vajadustele või soovidele ja rakendatud tingimustele vastavaid vorme (liine, tüvesid, sorte, tõuge). Suguliselt sigivate organismide (näit. koduloomad, kultuurtaimed) puhul seisneb kunstlik valik peamiselt valitud genotüüpidega (või fenotüüpidega) isendite kontrollitud ristamises ning järglaste valikus geneetiliste omaduste järgi.

 

Mardikatega Tribolium castaneum eksperimenteerides rakendati neile kunstlikku valikut 125 põlvkonna vältel. Sel teel saadi isendid, kelle nukkude kaal oli kahekordistunud. Kuna selekteeritud populatsioonist jäi kõigi indiviidide puhul ka kõige väiksemate nukkude kaal suuremaks algse populatsiooni kõige suuremate nukkude kaalust, tõestas see, et populatsioon oli geneetiliselt muutunud. Siiski ei kasvanud kunstliku valiku käigus saadud isendite nukkude keskmine kaal põlvkondade vältel ühtlaselt. Kui algul oli muutuste kiirus ennustatav, siis peale 40-ndat põlvkonda see aeglustus võrreldes eeldatavaga. Nagu selgus, olid mardikate suurem kasv ja paljunemisvõime negatiivses korrelatsioonis. Teatud piirist suuremaid mardikaid polnud enam võimalik selekteerida, sest seda takistas looduslik valik. Kui näiteks kunstliku valiku teel saadud isenditele pärast 50-ndat põlvkonda kunstlikku valikut edaspidi enam ei rakendatud, siis 110-ndaks põlvkonnaks oli populatsioon jälle algse suurusega. Seega tuleb kunstliku valiku puhul arvestada bioloogiliste objektide looduslikke limiite.

 

Genotüübi ja keskkonnatingimuste interaktsioon

 

Genotüübi ja väliskesskonna kompleksset interaktsioon iseloomustab hästi järgmine näide. Laboris tehti katseid rottidega, mõõtes nende edukust labürindi läbimisel. Osa rotte läbisid labürinti kiiresti, tehes vähe vigu ning neid hakati nimetama “nutikateks”. Identifitseeriti ka teine grupp katseloomi, keda nimetati “juhmideks”, kuna nad kulutasid labürindi läbimiseks oluliselt kauem aega ja tegid palju vigu. Rakendades kunstlikku valikut, aretati välja kaks erinevat rotiliini – nutikad ja juhmid. Kuigi geneetiliselt erinevad, avaldus nende juhmus või nutikus ainult teatud tingimustes – labürindi läbimiskatsetes. Kui rotid viidi mõnda teise keskkonda, ei olnud erinevusi märgata.

 

Inbriiding ja heteroos

 

Lähedalt suguluses olevate isendite ristumist nimetatakse inbriidinguks (inbreeding). Inbriidingu tulemusena suureneb populatsioonis homosügootide osakaal ja väheneb heterosügootide osakaal. Inbriidingu kõige ekstreemsem vorm on taimede iseviljastumine. Aa heterosügootide iseviljastumise tulemusena on järgmises põlvkonnas 50% homosügoote ning 50% heterosügoote. Kui ka selle põlvkonna taimed iseviljastuvad, siis nende järglaskonnas on heterosügootide osakaal vähenenud 25%-ni ja kui sama kordub ka järgmiste põlvkondade puhul, on 10-ndas põlvkonnas 99,9% homosügoote. Populatsioonides, kus inbriiding on tavaline, on homosügootsuse tase kõrgem ning avalduvad paljud retsessiivsed tunnused.

 

Inbriiding mõjutab kvantitatiivseid tunnuseid nagu näiteks keha suurus, elujõulisus, viljakus. Mida suurem on populatsioonis inbriidingu osakaal, seda väiksema elujõulisusega ja madalama viljakusega populatsioon on. Inbriidingu negatiivne efekt tuleneb kahjulike retsessiivsete alleelide avaldumisest homosügootides.

 

Kui ristumine toimub omavahel mittesuguluses olevate isendite vahel, nimetatakse seda autbriidinguks (outbreeding). Osadel taimedel on leitud lookus S mis kontrollib gameetidevahelist sobimatust. Näiteks alleeli S1 kandev tolmutera ei saa viljastada munarakku S1S2 taimedel, küll aga S2S3 taimedel. See mehhanism takistab homosügootide teket ristumise tulemusena. Autbriidingu tulemusena võime näha heteroosi efekti, kus hübriidid on vanematest elujõulisemad, seda eeskätt geneetiliselt erinevate inbriidingu tulemusena saadud homosügootsete vanemate ristamisel.

 

 

Kvantitatiivsete tunnuste molekulaarne analüüs

 

Geneetilisi lookusi, mis määravad kvantitatiivseid tunnuseid, tähistatakse QTL (quantitative trait loci). QTL lookusi kaardistatakse, kasutades genoomis leitud geneetilisi markereid. Molekulaarsete meetodite rakendamine nagu DNA sekveneerimine, restriktsioonisaitide polümorfism ja valkude elektroforees võimaldavad tuua välja erinevusi indiviidide vahel.  

 

Epilepsia puhul tuntakse erinevaid vorme. Teatud tüüpi epilepsiat põhjustav geen on lokaliseeritud 10-nda kromosoomi pikka õlga, epilepsia teistsugust vormi põhjustav geen aga 20-ndasse kromosoomi. Leitud on ka epilepsiat põhjustav geen 8-ndas kromosoomis.

 

Diabeet.

 

Diabeetikutel on glükoosi tase veres kõrge, kuna glükoosi kasutamine ja transport on häiritud insuliini puudumise või insuliini resistentsuse tõttu. Diabeet kahjustab neerude, silmade, närvide ja vererakkude funktsioone.

 

1.        Insuliinist sõltuv diabeet (tüüp I, IDDM). IDDM on autoimmuunhaigus, kus organismis toodetakse antikehi insuliini produtseerivate pankrease b-rakkude vastu. Sellised haiged vajavad insuliini teraapiat. Geen IDDM1 on lokaliseeritud kromosoomi 6 ning see on aheldunud HLA regiooniga (koesobivusantigeenid). 11-ndas kromosoomis on insuliini ja insuliini–laadset kasvufaktorit IGF kodeerivate geenide lähedalt leitud ka geen IDDM2, mille defektsus põhjustab samuti diabeeti. IDDM esineb eeskätt haigetel, kes kannavad HLA alleele DR4 ja DR3 või DQ. Ühemunakaksikutel avaldub diabeet mõlemal korraga ainult pooltel juhtudel, mis näitab, et ka keskkonnal on suur osa haiguse väljakujunemisel. IDDM võib olla indutseeritud näiteks viiruste poolt, kui viirused nakatavad  b-rakke. Immuunvastus, mis seejärel vallandub, võib olla nii tugev, et on suunatud kõigile b-rakkudele. Hiljutised uuringud on näidanud, et ka lehmapiima tarbimine võib põhjustada geneetiliselt vastuvõtlike indiviidide haigestumise diabeeti. Sel juhul kutsub piimas esinev veise albumiin esile molekulaarse mimikri. Antikehad, mida toodetakse neis indiviidides veise albumiini vastu, hävitavad ka b-rakke. Praeguseks on genoomiuuringute põhjal teada üle 20 sõltumatu kromosoomi regiooni, mille defektide korral on indiviid geneetiliselt vastuvõtlik diabeedile. Vastuvõtlikkusele aitavad kaasa ka mutatsioonid mitokondrites, kuna sel juhul võib olla häiritud oksüdatiivne fosforüleerimine, mis on vajalik insuliini sekreteerimiseks b-rakkude poolt.

 

2.        Insuliinist sõltumatu diabeet (tüüp II, NIDDM). Ligi 85%-il kõigist diabeedi juhtudest esineb NIDDM. NIDDM võib samuti olla geneetiline haigus, kuid selle geneetilisest taustast teatakse vähem. NIDDM kujuneb välja hiljem kui IDDM ning sel juhul ei ole tegemist autoimmuunhaigusega. Geneetiliselt kõige paremini on kirjeldatud diabeedi vormi MODY, mis on dominantselt päritav ning selle tekkes osalevad vähemalt kaks erinevat geeni. Haigete organism sekreteerib insuliini, kuid glükoosi metabolismis osalev glükokinaas (viib glükoosi glükoos-6-fosfaadiks) on resistentne insuliini suhtes. Vastav mutatsioon on lokaliseeritud 7-nda kromosoomi lühikesse õlga. Mutatsioonid glükokinaasis vähendavad ensüümi afiinsust glükoosile. Selle tulemusena tõuseb organismis glükoosi tase. Tüüp II diabeeti põhjustab ka mutatsioon glükogeeni süntetaasi geenis. Vastav ensüüm katalüüsib glükogeeni sünteesi glükoosist ning kui see süntees on takistatud, tõuseb samuti glükoosi tase organismis. Erinevalt IDDM-ist on NIDDM-i puhul keskkonnategurite osa haiguse väljakujunemisel tühine: ühemunakaksikutest on korraga mõlemad haiged peaaegu kõigil juhtudel.

 

 

<tagasi

6. Kromosoomid kui pärilikkuse kandjad

 

Kromosoomid   

 

Kromosoomid avastati 19. sajandi  teisel poolel saksa tsütoloogi W. Waldeyeri poolt. Kasutades erinevaid värvimistehnoloogiaid on nad kõige paremini jälgitavad jagunevates rakkudes. Interfaasis ei ole individuaalsed kromosoomid eristatavad, difuusset materjali, mis värvub, nimetatakse kromatiiniks. Kromatiini erinevad regioonid värvuvad erinevalt – nõrgemini eukromatiin ning tugevamini heterokromatiin, kus DNA kondensatsiooniaste on suurem.

 

Kromosoomide arv

 

Liigisiseselt on kõigil isenditel kromosoome kindel põhiarv n korduses. Tavaliselt on kordsusaste 2. Inimese kromosoomide põhiarv on 23: sugurakkudes on 23 kromosoomi (22 autosoomi + X või Y kromosoom) - haploidse genoom (n) ning somaatilistes rakkudes 46 kromosoomi – diploidne genoom (2n). Mõnedes maksarakkudes on kordsusaste 4 – sel juhul on tegemist tetraploidse genoomiga (4n) ning sel juhul on rakus 92 kromosoomi. Kromosoomide põhiarv erineb liigiti, kuid ei sõltu organismi keerukusastmest. Näiteks muntjakil (Aasias elutsev hirv) on 3 kromosoomi, aga osadel sõnajalgadel on neid mitusada. Enamikel juhtudel jääb see arv 10 ja 40 vahele.

 

Sugukromosoomid

 

Sugukromosoomide arv võib liigiti varieeruda. Rohutirtsudel on emastel üks sugukromosoom rohkem kui isastel: emastel on kaks X kromosoomi ning isastel üks. Seega on emased tsütoloogiliselt XX ning isased X0 (0 tähistab kromosoomi puudumist). Emaslooma rakkude meiootilise pooldumise käigus X kromosoomid paarduvad (konjugeeruvad) ja seejärel lahknevad ning kõigisse sugurakkudesse jääb üks X kromosoom. Isaslooma organismis jäävad aga pooled seemnerakud ilma X kromosoomita. Munaraku viljastamisel moodustuv sügoot sisaldab seega kas üks või kaks X kromosoomi, andes aluse kas isaste või emaste tirtsude arenguks.

 

Paljudel teistel loomadel ning ka inimesel on mõlemal sugupoolel võrdne arv sugukromosoome. Isaste (XY) sugukromosoomid lahknevad meioosi käigus, produtseerides võrdsel arvul X ja Y kromosoomi sisaldavaid gameete. Inimese puhul peaks viljastumise tulemusena tekkima teoreetiliselt võrdne arv XY ja XX sügoote. Tegelikult on Y kromosoomi sisaldavatel seemnerakkudel võrreldes teistega viljastamisel väike eelis – nii on XY:XX suhe 1,3:1. Kuna XY embrüod on võrreldes XX embrüotega vähem eluvõimelised, on sünnimomendiks see suhe juba 1,07:1 ning paljunemisikka jõudmisel on meeste ja naiste suhe 1:1.

 

Inimese Y kromosoom on X kromosoomist morfoloogiliselt eristatav: ta on tunduvalt lühem ning Y kromosoomi tsentromeer paikneb ühe kromosoomi otsa lähedal. Ühist geneetilist materjali on X ja Y kromosoomil vähe.

 

 

Pärilikkuse kromosoomiteooria

 

Eksperimentaalsed tõendid selle kohta, et geenide päritavus on seotud kromosoomidega

 

Kahekümnenda sajandi algul näitas Thomas Morgan, et teatav äädikakärbse Drosophila melanogaster silmavärvust mõjutav geen paikneb X kromosoomis. Tegemist oli silmade valget värvust põhjustava retsessiivse mutatsiooniga, mis avaldus ainult isastel kärbestel. Valgesilmsete mutantsete (w) isaste ristamisel homosügootsete (w+) emastega olid mõlemast soost järglased punaste silmadega, kuid hübriidide järgmises põlvkonnas olid kõik emased endiselt punaste silmadega, isastest aga ainult pooled. Morgan järeldas, et punast silmavärvust andev geen paikneb X kromosoomis. Kui on tegemist X kromosoomis paikneva geeniga ning isased on saanud mutantne alleeliga X kromosoomi, on kõik sellised isased valgete silmadega. Kuna tegemist on aga retsessiivse mutatsiooniga, siis on heterosügootsed emased punasesilmsed, sest kannavad lisaks mutantsele ka metsiktüüpi alleeli. Organismi, mis sisaldab ainult ühte geenikoopiat, nimetatakse hemisügootseks. Heterosügootsete emaste ristamisel valgesilmsete isastega saadi ka valgesilmseid homosügootseid emaseid, kes sisaldasid mõlemas X kromosoomis mutantset alleeli.    

 

Geenid paiknevad kromosoomides lineaarselt

 

Morgani grupp uuris geenide paiknemist äädikakärbse kromosoomides. Olles lokaliseerinud hulgaliselt erinevaid mutatsioone, leiti, et erinevad geenid asetsevad kromosoomis teatavates kohtades – lookustes. Edasi oli võimalik juba koostada geneetilisi kaarte ning arvutada geenidevahelisi suhtelisi kaugusi. Nii tuldi välja pärilikkuse kromosoomiteooriaga, mille kohaselt kõik geenid paiknevad kromosoomides ning Mendeli seadused tulenevad sellest, milliste seaduspärasuste alusel toimub kromosoomide lahknemine sugurakkudes ning sattumine järglaskonda.

 

 Kromosoomide mitteeraldumine raku jagunemisel

 

Morgani tudeng Bridges näitas, et ebanormaalne arv sugukromosoome XXX, XXY, X0 või Y0 põhjustab äädikakärbsel muutusi fenotüübis. Ta ristas mutantseid homosügootseid valgesilmseid emaseid (ww) punasesilmsete isastega (w+) ning leidis, et ebaootuspäraselt oli järglaskonnas ka üksikuid valgesilmseid emaseid ning punasesilmseid isaseid. Teoreetiliselt oleksid pidanud kõik emased järglaskonnas olema punasesilmsed ning isased valgesilmsed. Neil vähestel eranditel oli kahe sugukromosoomi asemel kas kolm või üks. Sugukromosoomide ebanormaalset arvu järglaskonnas põhjustas X kromosoomide mittelahknemine meioosiprotsessis. Selle tagajärje tekkisid kahte X kromosoomi sisaldavad ja X kromosoomita munarakud. Selliste munarakkude viljastamisel moodustusidki XXY sügoodid, millest arenesid valgesilmsed emased ning X0 sügoodid, millest arenesid punasesilmsed isased, kes olid sigimisvõimetud. Viljastamisel tekkis ka XXX ja Y0 sügoote, millest ei tulnud eluvõimelist järglaskonda. Seega olid ka Bridges’e katsetulemused heaks tõendusmaterjaliks pärilikkuse kromosoomiteooriale. Lisaks näitasid Bridges’e katsed X kromosoomi tähtsust Drosophila soo määramisel (XXY järglased on emased!). Selleks, et organism oleks vitaalne, on vajalik vähemalt ühe X kromosoomi olemasolu, sest Y0 sügootidest ei arenenud eluvõimelisi järglasi.

 

Mendeli seadused lähtudes kromosoomiteooriast

 

Lahknemisseadus

Raku esimese meiootilise jagunemise käigus homoloogilised kromosoomid paarduvad. Üks homoloog on pärit emalt, teine isalt. Kui ema on homosügootne alleeli A suhtes ja isa sama geeni alleeli a suhtes, on järglaskond Aa. Anafaasis, pärast esimest meiootilist jaotumist liiguvad Aa heterosügootide kromosoomid, mis sisaldavad alleele A ja a, raku erinevatele poolustele ning satuvad tütarrakkudesse

 

Sõltumatuse seadus e. sõltumatu lahknemisseadus

 

Ka see seadus baseerub anafaasis toimuval lahknemisel. Kui AA BB emaseid ristata näiteks aa bb isastega, on järglased Aa Bb. Esimese meioosi profaasis paarduvad kromosoomid alleelidega A ja a ning B ja b. Metafaasis reastuvad nad homoloogiliste paaridena kahel võimalikul viisil, kas A/a B/b või A/a b/B. Sõltuvalt sellele, kuidas on toimunud reastumine, liiguvad anafaasis erinevatele poolustele A ja B alleeliga ning a ja b alleeliga kromosoomid või hoopis alleele A ja b ning a ja B kandvad kromosoomid. Mõlemad võimalused realiseeruvad võrdse tõenäosusega. Pärast meiootilisi jagunemisi sisaldavad pooled gameetidest vanematega identset alleelikombinatsiooni, pooled aga uut (A b või a B). Nii moodustubki heterosügootsetel järglastel (F1 põlvkond) neli tüüpi gameete. Seega tagab kromosoomide lahknemine meioosis geenide sõltumatu lahknemise.   

 

Suguliitelised geenid inimesel

 

X-liitelised retsessiivsed alleelid on märksa kergemini tuvastatavad kui retessiivsed autosoomsed alleelid.

 

Hemofiilia

 

Hemofiiliat põhjustab X-liiteline mutatsioon, mille kandjatel ei sünteesita vere hüübimiseks vajalikku faktorit. Ilma terapeutilise vahelesegamise võib hemofiilikutel ka tühisem haav põhjustada verest tühjaks jooksmist. Peaaegu kõik selle puudega indiviidid on mehed. Hemofiilia juhtumeid esines ka Venemaa tsaari Nikolai II perekonnas. Tal oli 4 tütart ja üks poeg. Poeg Aleksei kannatas hemofiilia all, olles saanud vastava alleeli oma emalt, kes oli heterosügoot. Tsaarinna Aleksandra oli Inglismaa kuninganna Victoria tütretütar ning ka Victoria ise oli hemofiilia alleeli kandja.

 

Värvipimedus

 

Inimesel on värvuse tajumine vahendatud kolme valgust neelava valgu poolt – üks neist neelab sinist valgust, teine rohelist ja kolmas punast. Ükskõik, milline neist valkudest on defektne, tagajärjeks on värvipimedus. Kõige klassikalisem värvipimeduse näide on võimetus eristada rohelist ja punast värvust. Neid värve ei suuda eristada ligikaudu 10-15% meestest ning alla 1% naistest. X kromosoomis on leitud 2 geeni, millest üks kodeerib rohelise valguse retseptorit, teine punase valguse retseptorit. Sinise valguse retseptorit kodeeriv geen on autosoomis.

 

Fragiilne X

 

Paljud vaimse alaarenguga nähud on seotud muutustega X-liitelistes geenides. Fragiilse X-i sündroom avaldub lastel sagedusega 1:2000. Fragiilne X on X-liiteline dominantne kahjustus mittetäieliku penetrantsusega. Puuetega (vaimse alaarenguga) on heterosügootsed naised ja hemisügootsed mehed. On ka üksikuid erandeid, kus sümptomid ei avaldu. Haigust põhjustab geeniga FMR1 külgneva DNA järjestuse CGG kordistumine X kromosoomi otsa lähedal. Kui normaalses kromosoomis on 5-60 CGG kordust, siis mutantses kromosoomis on seda kordust DNA replikatsiooni tagajärjel kuni 1000 koopiat, mis mõjutab kordusega külgnevate geenide avaldumist. Fragiilse X-i sündroomi põhjustav mutatsioon on metafaasi kromosoomidel tsütoloogiliselt jälgitav. Tundub, nagu oleksid kromosoomi otsad murdumas.

 

Y kromosoomi-spetsiifilised geenid

 

Teatakse ainult väheseid. Üks neist kodeerib H-Y antigeeni. On teada ka geen, mis kodeerib testiste arenguks ning mehe seksuaalsete tunnuste väljakujunemiseks vajalikku faktorit TDF.

 

 

 

Geenid, mis paiknevad mõlemas sugukromosoomis

 

Mõned geenid on olemas nii X kui ka Y kromosoomis, paiknedes enamasti lühikese õla otsa lähedal. Nende geenide poolt kodeeritud tunnused päranduvad järglastele samal viisil nagu autosoomsete geenide poolt kodeeritud tunnused. Sellepärast nimetatakse neid geene ka pseudoautosoomseteks geenideks.

 

Soo määramine sugukromosoomide poolt

 

Soo määramine inimesel

 

Erinevalt äädikakärbsest määrab inimesel ja teistel imetajatel soo Y kromosoomi olemasolu. X0 indiviidid on naissoost ja XXY indiviidid meessoost. Y kromosoomis paiknev geen SRY kodeerib faktorit TDF (testis-determining factor). Selle geeni homoloog on leitud ka hiirel. TDF on regulaatorvalk, mis seondub DNA-ga, kontrollides nii teiste geenide avaldumist, mis on vajalikud testiste arenemiseks. Pärast testiste formeerumist kutsub testosterooni sekretsioon esile meessoole iseloomulike tunnuste väljakujunemise. Testosteroon on hormoon, mis seondub paljude rakutüüpide retseptoritele. Juhul, kui testosterooni signaalsüsteem on häiritud, need tunnused ei ilmne ning arenevad välja hoopis naissoole iseloomulikud tunnused. Vastavat südroomi nimetatakse testikulaarseks feminisatsiooniks.

 

Soo määramine äädikakärbsel

 

Normaalsel diploidsel kärbsel on 2 sugukromosoomi (XX või XY) ning 3 paari erinevaid autosoome (AA, kus iga A näitab ühte haploidset autosoomide kogumit, 2A diploidset). Soo määrab X kromosoomide suhe autosoomide kordsusesse: normaalsetel isastel on see suhe 0,5 (1X:2A) ning normaalsetel emastel 1,0 (2X:2A). 2X:3A ning 3X:4A puhul jääb suhe 0,5 ja 1,0 vahele ning arenevad mõlemad sootunnused (intersex), 2X:4A puhul on suhe 0,5 ning kärbsed isased. Põhiline geen, mille avaldumine mõjutab sugu, on X-liiteline geen Sxl. Kui X:A suhe on suurem või võrdne ühega, on Sxl geen aktiivne ja sügoodist areneb emane kärbes; kui see suhe on väiksem või võrdne 0,5-ga, on geeni avaldumine alla surutud ja järglased tulevad isased.

 

Soomääramine teistel loomadel

 

Kui isasloomal on kaks erinevat sugukromosoomi, X ja Y, nimetatakse tema sugu ka heterogameetseks. Emased, kes kannavad kahte X kromosoomi, on homogameetsed. Lindudel, liblikatel ja ka mõnedel roomajatel on olukord vastupidine: isased on homogameetsed (ZZ) ja emased heterogameetsed (ZW).

 

Mesilastel on sugu määratud ploidsusega e. kordsusega. Diploidsed embrüod, mis arenevad viljastatud munarakust, arenevad emasteks, haploidsed embrüod, mis pärinevad viljastamata munarakkudest, aga isasteks. Vastse toitmisest sõltub, kas emane valmik saab olema viljakas (emamesilane) või steriilne (töömesilane).  Et haploidsuse-diploidsuse süsteem jääks kehtima ka järglaskonnas, toimub munarakkude valmimine läbi meioosiprotsessi, seemnerakkude valmimine aga mitootilise jagunemise teel.

 

X-liiteliste geenide doosikompensatsioon

 

Kui emastel indiviididel on kaks X kromosoomi ning isastel ainult üks, siis kuidas saavutatakse see, et X-liiteliste geenide avaldumise tase on mõlemal juhul võrdne?

 

Drosophila X-liiteliste geenide hüperaktivatsioon isastel

 

Juhul, kui geeni Sxl produkti rakus pole (isased), seondub teatav valkkompleks paljudesse kohtadesse X-kromosoomil ja võimendab X-liiteliste geenide avaldumise taset kaks korda. Kui rakus on ka Sxl geeni produkti piisavalt, takistab see valkkompleksi seondumist ja seega ka geenide aktiivsuse tõusu.

 

X-liiteliste geenide inaktivatsioon imetajatel

 

Emastel on üks X kromosoomidest rakkudes inaktiivses olekus. Valik on juhuslik – osadel juhtudel on inaktiivne isalt päritud X, osadel aga emalt saadud X kromosoom. Seega sisaldavad nad võrdsel hulgal mõlemat tüüpi rakke, olles seetõttu X kromosoomi suhtes geneetilised mosaiigid. Emasloom, kes on heterosügootne X-liitelise geeni suhtes, võid omada samaaegselt kahte erinevat fenotüüpi. Näiteks kassidel ja hiirtel avaldub fenotüübiline mosaiiksus karva pigmentatsioonis. Kassidel kodeerib üks alleel tumedat pigmenti ning teine alleel oranzhi pigmenti. Heterosügootsed emakassid on laigulised, kilpkonna värvi.

 

X kromosoomi pikas õlas on piirkond, millest geenide inaktivatsioon levib mõlemas suunas. Vastavat initsiaatorkohta nimetatakse X-inaktivatsiooni keskuseks XIC (X-inactivation center). See keskus on väga lähedal geenile XIST, millel arvatakse olevat oluline roll inaktivatsiooni protsesis. Inaktiveeritud X kromosoom erineb teistest kromosoomidest, kuna inaktiivse X kromosoomi DNA on tugevalt keemiliselt modifitseeritud, metüleeritud. Lisaks on ta tugevamalt kondenseerunud, moodustades intensiivselt värvuvaid Barri kehakesi (nimetatud tsütoloogi Murray Barr järgi, kes need kehakesed esmakordselt tsütoloogiliselt tuvastas). Barri kehake kinnitub tuumamembraani sisepinnale ning tema replikatsioon ei ole teiste kromosoomidega sünkroonne. Sugurakke tootvates kudedes on ta reaktiveeritud, sest oogeneesis on vajalik, et mõnede X-liiteliste geenide mõlemad geenikoopiad oleksid aktiivsed.

 

<tagasi

7. Erinevused kromosoomide arvus ja struktuuris

 

Kromosoomide uurimise tsütoloogilised meetodid

 

Kromosoomide arvu ja struktuuri on võimalik uurida, värvides jagunevaid rakke teatavate värvidega ning vaadeldes värvunud kromosoome mikroskoobis. Vastavat teadusala, mis sellega tegeleb, nimetatakse tsütogeneetikaks. Kaasajal on tsütogeneetikal oluline rakenduslik väärtus meditsiinis. Tänu tsütogeneetikas kasutatavatele meetoditele on võimalik diagnoosida haigusi, mis on seotud kromosoomianomaaliatega.

 

Mitoosikromosoomide analüüs

 

Enamus tsütoloogilisi uuringuid teostatakse mitoosi metafaasi kromosoomidega, sest siis on need kõige paremini jälgitavad. Näiteks eraldatakse inimese verest valged vererakud ning kasvatatakse neid kultuuris, lisades kemikaale, mis stimuleerivad rakkude jagunemist. Metafaasi jõudnud rakke töödeldakse kemikaaliga, mis kahjustab mitoosikäävi ning peatab mitoosiprotsessi. Seejärel töödeldakse rakke hüpotoonilise lahusega, mille tulemusena rakud imevad end vett täis. Rakud lõhkevad vees ning laialipaiskunud kromosoome uuritakse mikroskoobiga. Pikka aega arvati, et inimesel on 48, mitte aga 46 kromosoomi. Alles tänu selle meetodi kasutusele võtmisele suudeti inimesel määrata tegelik kromosoomide arv. 

 

Kromosoomide nähtavale toomiseks kasutatakse erinevaid värve. Kuni 70-ndate aastate alguseni oli kasutusel Feulgen’i reagent, mis on purpurse värvusega ning reageerib DNA-s olevate suhkrujääkidega. Kuigi rutiinseks analüüsiks on see reagent veel praegugi kasutusel, kasutatakse detailsemateks uuringuteks DNA-ga interkaleeruvaid värve. Näiteks quinakriiniga värvides tulevad kromosoomides esile vöödid. Kuna tegemist on fluorestseeruva värviga, vaadeldakse preparaate UV-kiirguses. Igale kromosoomile on iseloomulik kindel vöödilisuse muster. UV-kiirguses helendavaid vööte on hakatud nimetama Q-vöötideks. Kasutatakse ka mittefluorestseeruvaid värve, näiteks Giemsa värvi. Sel  juhul ilmuvad sõltuvalt sellest, kuidas kromosoomipreparaati eelnevalt on töödeldud, kas G- või R-vöödid. R-vöötide puhul värvuvad alad, mis G-vöötide puhul olid heledad ja vastupidi.

 

Inimese karüotüüp

 

Inimesel on 46 kromosoomi: 44 autosoomi ja 2 sugukromosoomi. Autosoome tähistatakse suuruse alanevas järjekorras, numbritega 1 – 22. Kõige suurem on 1. kromosoom ja  kõige väiksem 21. kromosoom (ajaloolistel põhjustel on teine peaaegu sama väike autosoom tähistatud number 22-ga). X kromosoom on vahepealse suurusega ning Y kromosoom umbes sama suur kui 22. kromosoom.

Indiviidi kromosoomistiku tunnustekogumit, mida iseloomustab kromosoomide arv, suurus, tsentromeeri asukohast olenev kuju ja värvimuster (vöödilisus) nimetatakse karüotüübiks. Indiviidi karüotüübi uurimiseks kasutatavat kromosoomistiku süstematiseeritud fotokujutist ühe raku metafaasikromosoomidest, kus kromosoomipaarid on reastatud ja rühmitatud suuruse, kuju ja vöödimustri järgi, nimetatakse karüogrammiks. Suuruse ja kuju alusel jaotatakse inimese autosoomid 7-sse rühma A – G (A - suured metatsentrikud (tsentromeer on kromosoomi keskel); B - suured submetatsentrikud; C - keskmised submetatsentrikud; D - suured akrotsentrikud (tsentromeer ühes kromosoomi otsas); E - väikesed submetatsentrikud; F - väikesed metatsentrikud; G - väikesed akrotsentrikud. Kromosoomi lühemat õlga tähistatakse tähega p (prantsusekeelsest sõnast petite tähendusega “väike”) ning pikemat õlga tähega q (järgneb tähestikus p-le). Nii on 5-nda kromosoomi väike õlg tsütogeneetikute kirjapildis 5p.

 

Meioosikromosoomide analüüs

 

Võrreldes mitoosikromosoomidega on meioosikromosoome tunduvalt raskem tsütoloogiliselt analüüsida. Ja seda mitmel põhjusel. Esiteks, meiootiline jagunemine toimub ainult spetsiifilistes kudedes sugurakkude moodustumisel. Teiseks, meiootiliselt jagunevaid rakke on laboritingimustes raske kultiveerida. Klassikalised meioosikromosoomide uuringud on teostatud taimse materjaliga, mis pärineb maisilt või erinevatelt liilialistelt. Taime õitelt eraldatakse paljunemisorganid ja kraabitakse materjali sugurakke tootvast koest. Meioosikromosoome on uuritud ka kõrgematel loomadel, kaasa arvatud inimene, kuid sel juhul tuleb vajaliku materjali hankimida elusorganismilt.

 

Tsütogeneetiline varieeruvus

 

Samatüübiliste e. homoloogiliste kromosoomide kordsust indiviidi või raku kromosoomistikus nimetatakse ploidsuseks. Ploidsust kirjeldatakse kromosoomide basaalarvu n (kromosoomide arv ühes kromosoomikomplektis) kaudu. Diploidsetes rakkudes on 2 kromosoomikomplekti, seega 2n kromosoomi, triploidsetes 3, seega 3n, jne. Organisme, mis sisaldavad täielikku, normaalset kromosoomikomplekti, nimetatakse euploidseteks, vastandina aneuploidsetele organismidele, kus mõni kromosoom komplektist on üle- või alaesindatud. Polüploidsed on organismid, mille rakud sisaldavad lisaks normaalsele kromosoomide arvule ühte või mitut lisakromosoomikomplekti.

 

Polüploidsus

 

Võrreldes loomadega on polüploidsus enam levinud taimede puhul, kuna paljud taimed on võimelised paljunema mitteseksuaalsel teel, vegetatiivselt. Loomadel, kes üldjuhul paljunevad seksuaalsel teel, on polüploidsus harv, sest see takistaks soomääramise mehhanismi toimimist. Polüploidide rakud on suuremad, sageli kajastub see ka organismi enda suuremas kasvus. Sellised taimed produtseerivad suuremaid seemneid ja vilju ning on suuremate õitega, mis on eriti soodne toiduks kasutatavate taimede ja ilutaimede puhul.

 

Steriilne polüploidsus

 

Paljud polüploidsed liigid on steriilsed, kuna meioosi käigus lahknevad kromosoomid ebaregulaarselt, mille tulemusena moodustuvad aneuploidsed gameedid. Kui sellised gameedid ühinevad viljastumisel, ei arene sügootidest elujõulisi järglasi. Näiteks triploidse taime gameetide moodustumisel paarduvad meioosi alguses kaks homoloogilist kromosoomi, kolmas jääb aga üksinda. On ka võimalus, et kõik 3 homoloogi ühinevad. Homoloogiliste kromosoomide lahknemisel anafaasis on variante palju: mõned homoloogilistest kromosoomidest liiguvad kõik ühele poolusele, mõned kahekaupa, mõned üksikult. Kuna triploidsed taimed on steriilsed, paljundatakse neid vegetatiivselt (banaanid, teatud õunapuu sordid, tulbid). Polüploidsed taimed võivad looduslikult paljuneda apomiksise teel (näit. võilill). Sel juhul arenevad seemned modifitseeritud meioosi läbinud munarakkudest, kus kromosoomide arv ei ole vähenenud.

 

Viljakad polüploidid

 

Enamis tetraploide on samuti steriilsed, kuid on ka erandeid. Täpsemad uuringud näitasid, et sellised tetraploidid sisaldasid kahte erinevat kromosoomikomplekti, mis pärinesid liigiliselt lähedastelt eellastelt. Hübriidis kromosoomid duplitseerusid, moodustades tetraploidi. Meioosis paardusid ühelt eellaselt pärinevad homoloogilised kromosoomid omavahel ning teiselt eellaselt pärinevad jällegi omavahel ning jaotusid seejärel regulaarselt. Nii sattus kõigisse sugurakkudesse võrdne arv kromosoome. Sel viisil paljuneb näiteks ka laialdaselt kasutusel olev teravili nisu, mis on heksaploidne (sisaldab kolme erinevat kromosoomikomplekti 7-st kromosoomist, mis duplitseerusid, nii et somaatilistes rakkudes on 42 ja sugurakkudes 21 kromosoomi). Lähis-Idast on praegugi veel leitud 7 kromosoomiga nisu metsikuid eellasi. Seega on polüploidid, mida saadakse lähedaste kuid erinevate liikide hübridiseerimisel (allopolüploidid), märksa suurema tõenäosusega viljakad kui need, mida saadakse sama liigi siseselt (autopolüploidid), sest esimesel juhul tekib kromosoomide lahknemisel vähem kõrvalekaldeid.

 

Polüploidsuse teke

 

Lisaks kromosoomide duplitseerumisele liikidevahelistes hübriidides võivad polüploidsed taimed areneda ka meristeemirakkude mitoosihäirete tagajärjel. Näiteks ei lahkne tütarkromatiidid mitoosi käigus ning selle tulemusena moodustuvad tetraploidsed rakud. Kui selliseid rakke sisaldavast koest kasvatada uus taim, ongi see tetraploidne. Kromosoomide kahekordistumine võib aset leida ka meioosis, kui ükskõik kummas meiootilises jagunemises kromosoomid ei lahkne ning moodustuvad diploidsed gameedid.

 

Katsed luua uusi polüploide laboritingimustes

 

1920-ndatel aastatel üritas vene teadlane Karpechenko luua redise ja kapsa hübriidi. Tal õnnestuski saada viljakad hübriidid, kuid kahjuks realiseerus erinevalt oodatule (taimedel on redise juur ja kapsa lehed) hoopis vastupidine variant, mis oli täiesti söödamatu.

Katseliselt indutseeritakse polüploidide teket sageli mitoosikäävi mürkidega, näiteks kolhitsiiniga.

 

Koe-spetsiifiline polüploidsus ja polüteenia

 

Mõnede organismide puhul muutuvad mõned koed arengu käigus polüploidseteks, kusjuures ülejäänud jäävad diploidseteks. Polüploidsus kujuneb vastuseks vajadusele suurendada geenikoopia arvu raku kohta. Vastavat protsessi nimetatakse endomitoosiks, sest see sisaldab rakusisest kromosoomide duplitseerumist ja tütarkromatiidide lahknemist, kuid ei toimu raku pooldumist. Inimesel leidub endomitoosi teel moodustunud tetraploidseid rakke maksas ja neerus.

 

Polüploidiseerumine võib toimuda ka sel viisil, et tütarkromatiidid ei eraldu. Nii moodustuvad polüteenkromosoomid, mis võivad koosneda paljudest paralleelselt kulgevatest kromosoomi replikatsiooniproduktidest. Kõige silmatorkavamad polüteenkromosoomid on kirjeldatud Drosophila vastsete süljenäärmetes. Iga kromosoom replitseerub 9 tsüklit, mille tagajärjel tekib 500 koopiat. Kõik koopiad paarduvad omavahel ning mikroskoopiliselt on polüteenkromosoomid jälgitavad jämedate kimpudena juba väikese suurendusega. Kromatiini kondenseerumisaste on polüteenkromosoomide erinevates piirkondades erinev. Seetõttu tulevad värvimisel nähtavale heledad ja tumedad vöödid, võimaldades analüüsida kromosoomi struktuuri.

Polüteenkromosoomidel on kaks iseloomulikku omadust:

1.         Homoloogilised polüteenkromosoomid paarduvad ka somaatilistes rakkudes. Paardumine on täpne, mistõttu igale kromosoomile iseloomulikud vöödid on veelgi paremini jälgitavad.

2.         Polüteenkromosoomide tsentromeerid moodustavad tugevalt värvuva struktuuri, mida nimetatakse kromotsentriks. Kromotsentriga külgnev ala värvub samuti tugevalt. Kromosoomi õlad, mis on vöödilised, koosnevad eukromatiinist, kus paikneb enamus geenidest. Tugevalt värvunud ala kosneb heterokromatiinist, milles on väga vähe geene.

 

Polüteenkromosoomid on jälgitavad interfaasi rakkudes. Just see teebki nad oluliseks, sest muidu on kromosoomide ehitust võimalik uurida üksnes jagunevates rakkudes. Polüteenkromosoome on leitud ka paljudel teistel kärbestel ning moskiitodel.

 

Aneuploidsus

 

Aneuploidsus kirjeldab olukorda, kus üksik kromosoom on võrreldes ülejäänutega erineva kordsusega. Isendid, kes sisaldavad lisakromosoomi või kellel teatav kromosoom puudub, on aneuploidid. Aneuploidsusest räägitakse ka siis, kui puudub või on kordsuses osa kromosoomist, näiteks kromosoomi õlg. Need organismid, kellel teatav kromosoom või osa kromosoomist on alaesindatud, on hüpoploidid, kui aga üleesindatud, siis hüperploidid. Teatava kromosoomi kolmekordistumisel on tegemist trisoomiaga. Aneuploidsus annab tugeva fenotüübilise efekti.       

 

Trisoomia inimesel

 

Enimtuntud anomaalia inimesel on 21. kromosoomi trisoomia, mis põhjustab Downi sündroomi. Teadmata midagi veel kromosoomidest, kirjeldas seda sündroomi esmalt möödunud sajandi keskpaigas Inglismaal töötav arst Langdon Down. Downi sündroomiga inimesed on tüüpiliselt lühikest kasvu, kühmus, suure koljuga, laiade ninasõõrmetega, pika keelega, mis on silmatorkavalt kurruline ja rohmakate kätega. Samuti on nad vaimselt alaarenenud, mistõttu vajavad spetsiaalset väljaõpet ja hooldust. Downi sündroomiga indiviidide karüotüüpi tähistatakse 47, XX (või XY), +21. Trisoomiat põhjustab homoloogiliste kromosoomide mittelahknemine meioosiprotsessi käigus. See võib toimuda nii isa kui ka ema sugurakkude moodustumisel, kuid just ema puhul kasvab selle tõenäosus vanuse suurenedes märgatavalt. Riski tõus on seotud sugurakkude küpsemise omapäraga naise organismis. Meioos, mis viib sugurakkude moodustumisele, algab küll juba looteeas, kuid peatub ja kulgeb lõpuni alles viljastumise momendiks. Selle ajani on meioos peatunud esimese jagunemise profaasi staadiumis, kus homoloogilised kromosoomid peavad hakkama paarduma. Mida pikemat aega jäävad rakud profaasi, seda suurem on tõenäosus, et paardumist ei toimu ning kromosoomide jaotumine on häiritud.

 

Kirjeldatud on ka kromosoomide 13 ja 18 trisoomiat, kuid märksa harvemini. Sel juhul on fenotüübilised muutused markantsemad ning vastsündinud surevad mõne nädala jooksul. X kromosoomi trisoomia puhul on indiviidid eluvõimelised naised, fenotüübiliselt normaalsed, mõnikord siiski kergelt vaimsete puuetega ja vähenenud viljakusega. 47, XXX anomaalia ei kutsu esile silmatorkavaid fenotüübilisi muutusi seetõttu, kuna 2 X kromosoomi 3-st on inaktiveeritud, jättes aktiivseks ainult ühe nii nagu ka normaalsetel XX naistel.

47, XXY indiviidid on fenotüübilt mehed, kuid omavad ka mõningaid naissoole iseloomulikke sekundaarseid sootunnuseid ja on enamasti steriilsed. X kromosoome võib ka rohkem olla. Vastavat sündroomi nimetatakse Klinefelteri sündroomiks, mida iseloomustavad väikesed testised, suurenenud rinnad, pikad jäsemed, teravad põlved ning vähenenud karvakasv kehal. Kui X kromosoome on enam kui kaks, lisanduvad ka vaimsed puuded.

 

47, XYY karüotüübiga mehed on lühemad kui XY mehed. Diskuteeritud on selle karüotüübi võimaliku seose üle kriminogeensusega.

 

 

 

Monosoomia

 

Turneri sündroomi (45, X) puhul on indiviidid fenotüübilt naised, kuid kuna nende munasarjad pole arenenud, siis steriilsed. Nad on kasvult lühemad, südamehäiretega ja kuulevad halvasti. Teisi monosoomia juhtumeid inimeste puhul ei teata. 45, X naistel ei ole rakkudes Barri kehakesi. Tekib küsimus, miks nad siiski erinevad normaalsetest naistest, kellel üks X kromosoom on inaktiveeritud. Vastus peitub selle, et XX naiste puhul jäävad mõned geenid aktiivseks ka teises X kromosoomis, mis on vajalik, et organismi kasv ja areng toimuksid normaalselt. Lisaks, selleks et areneks munasari ja toimuks normaalne oogenees, on vaja, et mõlemad X kromosoomid oleksid aktiivsed.

 

Kromosoomide segmentide deletsioonid ja duplikatsioonid

 

Kromosoomi segmendi puudumist nimetatakse deletsiooniks. Suuri deletsioone on võimalik tsütoloogiliselt tuvastada. Inimesel on kirjeldatud 5-nda kromosoomi lühikese õla deletsiooni 46(5p-) ja sellele vastavat cri-du-chat sündroomi (tuleneb prantsusekeelsest väljendist tähendusega “kassi kräunumine”). Selle sündroomiga kaasnevad tõsised nii vaimsed kui ka füüsilised puuded ning haigete häälitsemine meenutab kassi kräunumist.

 

Kromosoomisegmendi kahekordistumist nimetatakse duplikatsiooniks. Näiteks kromosoomi 21 pikem õlg võib seonduda 14-nda kromosoomi külge. Juhul, kui selline liitkromosoom kombineerub normaalsete kromosoomidega number 14 ja 21, on indiviid fenotüübiliselt normaalne, kui aga normaalse 14-nda kromosoomi ja kahe normaalse kromosoomiga number 21, on indiviid 21. kromosoomi suhtes suures osas trisoomne ning Downi sündroomiga.

 

Äädikakärbsel on duplitseerunud regioone lihtne ära tunda polüteenkromosoomide vaatlemisel. Näiteks X kromosoomi keskmise segmendi tandeemne duplikatsiooni kandvatel kärbestel on väiksemad silmad. Vastavat mutatsiooni Bar sisaldava polüteenkromosoomi duplitseerunud segmendid paarduvad omavahel, tekitades sõlmekujulise moodustise. Võimalik on tuvastada ka deletsioone, sest siis tuleb nähtavale lingukujuline homoloogiliste kromosoomide mittepaardunud ala. Kaasajal on võimalik deletsioone ja duplikatsioone kergesti tuvastada molekulaarsete meetoditega. Kuid sellest tuleb juttu hiljem.

 

Ümberkorraldused kromosoomide struktuuris

 

Ümberkorraldused kromosoomides võivad muuta segmendi positsiooni kromosoomis või viia ta teise kromosoomi.

 

Inversioonid

Inversiooniga on tegemist sel juhul, kui segment kromosoomist on ülejäänud osa suhtes 180° suhtes ümber pööratud. Laboritingimustes saab selliseid ümberkorraldusi kunstlikult esile kutsuda röntgenkiirtega kiiritades, mis põhjustab kromosoomide fragmenteerumist. Mõnikord võivad segmendid uuesti ühineda, kuid nende orientatsioon võib olla muutunud. Inverteerumist võivad põhjustada ka transponeeruvad elemendid – DNA järjestused, mis on võimelised liikuma genoomi ühest osast teise.

 

Tsütogeneetikas eristatakse kahte tüüpi inversioone: peritsentrilised inversioonid kaasavad tsentromeeri, paratsentrilised aga mitte. Peritsentrilise inversiooni tagajärjel võivad muutuda kromosoomi õlgade pikkused, nii võib akrotsentrilisest kromosoomist tekkida peritsentriline kromosoom. Seetõttu on peritsentrilisi inversioone lihtsam tuvastada kui paratsentrilisi.

 

Juhul, kui üks homoloogilistest kromosoomidest sisaldab inversiooni, teine aga mitte, toimub nende paardumine sel viisil, et inversiooni sisaldav regioon on teisel kromosoomil sama orientatsiooni saavutamiseks linguna ümber pööratud. Inversiooni sisaldava ala otstes on kromatiidid pinge all ja see võib viia neis kohtades sünapsi katkestamisele. Enamasti on meioosi käigus inversioonidest põhjustatud linge tsütoloogiliselt praktiliselt võimatu jälgida. Siin tulevad jällegi appi polüteenkromosoomid, mis paarduvad ka somaatilistes rakkudes. Tänu spetsiifilisele vöödilisuse mustrile on linguna paiknevaid inverteerunud alasid kerge identifitseerida.

 

Translokatsioonid

 

Kui segment kromosoomist satub temaga mittehomoloogilisse kromosoomi, on tegemist translokatsiooniga. Ka translokatsioone saab stimuleerida röntgenkiirtega ning protsessis võivad osaleda ka transponeeruvad elemendid. Kui kaks mittehomoloogilist kromosoomid vahetavad võrdsel hulgal geneetilist materjali, on tegemist retsiprookse translokatsiooniga. Meioosis võivad retsiprookset translokatsiooni sisaldavad muus osas mittehomoloogilised kromosoomid lisaks homoloogiliste kromosoomidega paardumisele ka omavahel paarduda, moodustades ristikujulisi struktuure. Kuna ristikujuliselt paardunud struktuuril on 4 tsentromeeri, võib homoloogiliste kromosoomide lahknemine olla häiritud ja moodustuvad aneuploidsed gameedid.

 

Liitkromosoomid (Compound Chromosomes). Robertsoni translokatsioonid

 

Mõnikord ühineb kromosoom oma homoloogiga või liituvad tütarkromatiidid, moodustades ühe geneetilise üksuse. Liitkromosoomid püsivad stabiilselt seni, kuni neil on üks tsentromeer. Liitkromosoomid võivad moodustuda ka homoloogiliste kromosoomide segmentide ühinemisel. Näiteks äädikakärbsel on kirjeldatud liitkromosoomi, mis moodustus kromosoomi number  2 homoloogide paremate õlgade liitumise tulemusena. Sellist kromosoomi nimetatakse isokromosoomiks, kuna tema mõlemad õlad on samad. Liitkromosoomide moodustumine erineb translokatsioonidest selle poolest, et liitkromosoomid moodustuvad üksnes homoloogiliste kromosoomide baasil, translokatsioonide puhul liitub aga geneetiline materjal, mis pärineb mittehomoloogilistelt kromosoomidelt.

 

Mittehomoloogiliste kromosoomide puhul võib kromosoomiosade liitumine toimuda ka tsentromeeride vahendusel, nii et moodustub struktuur, mida nimetatakse Robertsoni translokatsiooniks. Sel juhul moodustuvad pikkade õlgadega metatsentriline kromosoom ning väike, lühikeste õlgadega, mis läheb kergesti kaotsi. Evolutsiooni käigus on selliseid kromosoomide liitumisi toimunud üsna sageli.

 

Kromosoomid võivad liituda ka otste vahendusel, mille tulemusena moodustub kahe tsentromeeriga struktuur. Juhul, kui üks tsentromeeridest inaktiveerub, jääb liitunud kromosoom stabiilseks. Selline liitumine on ilmselt toimunud ka meie endi liigi evolutsiooni käigus. Inimese 2. kromosoom on metatsentriline, tema õlad vastavad kahele erinevale akrotsentrilisele kromosoomile ahvidel. Teatavasti on inimesel 46 kromosoomi, shimpansil aga 48.

 

 

 

Kromosoomides toimunud geneetilise materjali ümberkorraldustest tulenevad fenotüübilised muutused

 

Homosügootses olekus on mitmeid geene haaravad deletsioonid peaaegu et alati letaalsed, sest ei toodeta mõnda organismile elutähtsat valku. Homosügootsete duplikatsioonide fenotüübiline efekt ei ole nii drastiline. Heterosügootses olekus mõjutavad nii deletsioonid kui ka duplikatsioonid fenotüüpi sel viisil, et muutunud on teatavate geenide ekspressioonitase. Fenotüübiline efekt on seda tugevam, mida suuremat kromosoomisegmenti ümberkorraldus hõlmab. Samuti sõltub muudatuse toime organismi vitaalsusele sellest, millist piirkonda muudatus hõlmab. Mõnikord võivad isegi kitsast regiooni hõlmavad deletsioonid ja duplikatsioonid olla letaalsed ning seda ka heterosügootses olekus. Sel juhul jäävad sinna regiooni geenid, mille puhul on väga oluline doos – juba üks geeni lisakoopia või teise geenikoopia puudumine on organismile letaalne. Selliseid geene, mille inaktivatsioon heterosügootses olekus on letaalse toimega, nimetatakse haplo-letaalseteks. Geenid, mille duplikatsioonid on organismile letaalsed, on triplo-letaalsed.  

 

Ka inversioonid ja translokatsioonid mõjutavad fenotüüpi. Kromosoomid võivad katkeda keset geene, inaktiveerides need. Isegi siis, kui terve geen satub uude konteksti, võib tema avaldumistase muutuda ja mõjutada selle läbi organismi fenotüüpi. Näiteks äädikakärbse silmavärvust kontrolliv geen white satub X kromosoomis toimunud inversiooni tagajärjel heterokromatiini sisaldava tsentromeeri lähedale, mistõttu selle geeni avaldumine on häiritud. Selle tulemusena on kärbse silma pigment ebaühtlaselt jaotunud. Põhjus on selles, et heterokromatiini sisaldavad alad jäävad tugevalt kondenseerunud olekusse kogu rakutsükli vältel.

<tagasi

 

8. Aheldumine, ristsiire (crossing over) ja eukarüootsete kromosoomide kaardistamine

 

Aheldumine, rekombinatsioon ja ristsiire

 

Alfred Sturtevant, kes oli samuti Thomas Morgani õpilane, tegeles Drosophila kromosoomide kaardistamisega ning oli üldse esimene, kes tuli välja kromosoomikaardiga. Kaartide koostamise aluseks olid mutantide ristamistulemused. Sturtevant lähtus kaardistamisel sellest, et samas kromosoomis paiknevad geenid peaksid päranduma koos. Kuna nad kuuluvad füüsiliselt samasse üksusesse, jäävad nad kokku ka pärast meioosi. Sellist nähtust nimetatakse geenide aheldumiseks.

 

Teatud juhtudel ei jää geenid aheldatuks. Meioosiprotsessi käigus võivad geenid  rekombineeruda. Meioosi algfaasis on homoloogiliste kromosoomide paardumisel e. konjugeerumisel jälgitavad nendevahelised ühendused – kiasmid. Neist kohtadest toimub homoloogiliste kromosoomide kromatiidiosade vahetus e. ristsiire (ingl. k. crossing over). 

 

Kõrvalekalded Mendeli sõltumatu lahknemise seadusest

 

Bateson ja Punnett ristasid suhkruherneid, mis erinesid teineteisest kahe tunnuse suhtes – õite värvus ning tolmuterade kuju. Punaste õitega ja pikkade tolmuteradega taimede ristamisel valgete õite ja ümarate tolmuteradega taimedega saadi punaste õitega ja piklike tolmuteradega järglased. Sellest võis järeldada, et punane õievärv ning tolmuterade piklik kuju on domonantsed tunnused. Hübriidide iseviljastumisel saadi nelja fenotüübiga järglasi, kuid nende fenotüüpide suhe erines oluliselt oodatavast suhtest 9:3:3:1. 1000 järglase hulgas oli võrreldes rekombinantidega (26 ja 24)  ebaproportsionaalselt palju punaste ja piklike tolmuteradega taimi (583) ning valgete õitega ja ümarate tolmuteradega taimi (170). Tegelik suhe oli seega 23,3:1:1:6,8. Kõrvalekalle tulenes sellest, et õite värvust ning tolmuterade kuju määravad geenid olid aheldunud. Kuna F2 järglaskonnas oli ka punaste õitega ja ümarate tolmuteradega ning valgete õitega ja piklike tolmuteradega taimi, sisaldasid F1 põlvkonnas moodustunud gameedid osadel juhtudel rekombinantset DNA-d, kus ühe geeni alleelid olid teise geeni alleelide suhtes vahetunud.

 

Rekombinatsiooni sagedus võimaldab mõõta geenide aheldatuse määra

 

Geenid, mis paiknevad üksteise suhtes lähestikku, on tugevamalt aheldunud ning rekombineeruvad harvemini. Seega võimaldab geenidevahelise rekombinatsiooni sagedus hinnata nendevahelist aheldatust. Rekombinatsioonisageduse arvutamiseks ristatakse uuritavate tunnuste suhtes aheldunud geenidega isendeid, näiteks eelpoolkirjeldatud heterosügootseid F1 põlvkonna suhkruherneid mõlema retsessiivse alleeli suhtes homosügootsete suhkruhernestega ja jagatakse rekombinantide arv kogu järglaskonna arvuga. Kui rekombinatsiooni pole toimunud, peaksid 50% järglastest olema fenotüübilt sarnased ühele vanemale ja 50% teisele vanemale. Oletame, et 1000-st järglasest 450 sarnanesid fenotüübilt  heterosügootsele F1 põlvkonnast vanemale (punaseõielised, pikkade tolmuteradega) ja 470 homosügootsele retsessiivsele vanemale (valgete õitega, ümarate tolmuteradega). Oli ka rekombinante: 42 punaste õitega ja ümarate tolmuteradega ning 38 valgete õitega ja piklike tolmuteradega hernetaime – kokku 80 rekombinanti. Seega jagatakse rekombinantide arv 80 kõigi järglaste arvuga (80 + 450 + 470). Konkreetsel juhul on jagatis 0,08, mis näitab, et rekombinatsioon toimus 8%-lise sagedusega. Rekombinatsioonisagedus kahe geeni vahel ei ületa kunagi 50%. Kui arvutused seda näitavad, pole geenid aheldunud, vaid paiknevad erinevates kromosoomides.

 

Selleks, et eristada heterosügoote erinevate alleelide omavahelise aheldatuse suhtes, on võetud kasutusele kindel kirjaviis. Oletame, et heterosügootsel taimel on kaks dominantset alleeli R ja L ning kaks heterosügootset alleeli r ja l. Kui me kirjutame nende taimede genotüübi R L / r l, tähendab see seda, et ühelt vanemalt pärandusid omavahel aheldunud on alleelid R L ning teiselt vanemalt alleelid r l. Kui taimede genotüüp on kirjutatud R l / r L, on omavahel aheldunud dominantsed ja retsessiivsed alleelid.

 

Rekombinatsioon toimub ristsiirde tulemusena

 

Rekombinantsed gameedid moodustuvad homoloogiliste kromosoomide ristsiirde tagajärjel. Ristsiire toimub esimese meiootilise jagunemise profaasi staadiumis, kui homoloogilised kromosoomid omavahel paarduvad. Kuna selleks ajaks on geneetiline materjal kahekordistunud, osalevad protsessis neli homoloogilist kromatiidi, moodustades tetraadi. Samas toimub konkreetne ristsiire kahe homoloogilise kromatiidi vahel. Sellest kohast ülejäänud kaks kromatiidi ei rekombineeru. Seega iga ristsiirde toimumise tagajärjel on neljast kromatiidist rekombinantsed kaks. Tõendusmaterjal sellele pärineb katsetest pagaripärmiga Saccharomysec cerevisiae. See üherakuline haploidne organism paljuneb tavaliselt mitteseksuaalsel teel, pungumisega. Sugulisel paljunemisel liituvad kaks haploidset erineva ristumistüübiga rakku a ja a, mille tulemusena moodustunud diploidne rakk läbib meioosi. Meioosi tulemusena tekib 4 haploidset rakku, askospoori, mis jäävad kokku kotikesse, mida nimetatakse askuseks. Seega sisaldab iga askus ühe konkreetse meioosi produkte. Askospooridest arenevad jälle haploidsed pärmirakud. Pärmirakke saab laboritingimustes kultiveerida tardsöötmetel, mis on valatud Petri tassidele. Iga rakk paljuneb söötmel, moodustades rakkude koloonia. Pagaripärmil on kirjeldatud palju erinevaid mutante, mida iseloomustavad kindel koloonia kuju ja võime/võimetus kasvada erinevatel söötmetel. Mikroskoobi all on võimalik meioosiprotsessi käigus moodustunud askused üksteisest eraldada, isoleerida üksikud askospoorid, viia need sobivale söötmele Petri tassil ning kirjeldada söötmel moodustunud kolooniate kuju ja kasvuomaduste põhjal mutantsete geenide vahel meioosi käigus toimunud rekombinatsioone.

 

Just katsetest pagaripärmiga ilmnes, et ristsiire toimub pärast seda, kui homoloogilised kromosoomid on duplitseerunud. Juhul, kui on aset leidnud üks rekombinatsioonisündmus, sisaldub askuses kaks rekombinantset (A b ja a B) ning kaks mitterekombinantset askospoori (A B ja a b), millel kõigil on erinevad fenotüübid. Kui rekombinatsioon oleks toimunud enne kromosoomide duplitseerumist, oleks askuses ainult kahetüübilisi askospoore ning kõik need oleksid rekombinantsed.

 

Nagu juba eelpool mainitud, ilmnes katsetest pagaripärmiga S. cerevisiae ka see, et igas kindlas ristsiirde kohas osalevad korraga kaks kromatiidi. Samas võivad ülejäänud kaks kromatiidi rekombineeruda mõnes teises kohas. Nii võib sõltumatult toimuda mitmeid erinevaid geneetilise informatsiooni vahetusi. Ristsiire toimub ka tütarkromatiidide vahel, kuid sel juhul me seda ei tuvasta, kuna tütarkromatiidid on geneetiliselt identsed.

 

Tõendid selle kohta, et ristsiire põhjustab geneetilise materjali rekombineerumist

 

Curt Stern tegi katseid äädikakärbestega. Selleks, et jälgida visuaalselt, et geneetiline rekombinatsioon on seotud geneetilise materjali vahetusega kromosoomide vahel, uuris ta erineva pikkusega X kromosoomides asuvate mutantsete tunnuste pärandumist ning järglaste X kromosoomide kuju. Üks X kromosoomidest oli normaalsest pikem (Xl), sest tema lühikesse õlga oli translokeerunud tükike Y kromosoomist. Teine X kromosoom oli normaalsest lühem (Xs), sest ta oli kaotanud translokatsiooni tulemusena 4-nda väikese kromosoomi vahel osa oma pikast õlast. See kromosoom sisaldas kahte mutatsiooni – dominantset mutatsiooni Bar (muudab silmakuju pikaks ja kitsaks) ning retsessiivset mutatsiooni car (silmade roosa värvus). Pikk kromosoom sisaldas metsiktüüpi alleele. Stern ristas emaseid heterosügootsei kärbseid, kes kandsid pikka ja lühikest X kromosoomi, normaalsete isastega. Järglaste hulgas oli ka selliseid, kus kaks ebanormaalset X kromosoomi olid rekombineerunud. Rekombinatsiooni tulemusena oli üks kromosoomidest normaalse pikkusega (B+ car) ning teisel olid mõlemad õlad ebanormaalsed (B car+).

 

Ka katsed maisiga  (Barbara McClintock ning Harriet Creighton said samad tulemused sõltumatult) tõendasid, et rekombinatsioon on seotud homoloogilistes kromosoomides paikneva geneetilise materjali vahetusega.

 

Homoloogiliste kromosoomide vahelised kiasmid ilmuvad nähtavale pärast ristsiirde toimumist

 

Kiasmid on selgelt näha meioosi profaasi lõpuosas. Sel hetkel on homoloogilised kromosoomid omavahel kontaktis ainult kiasmide ja tsentromeeri kaudu, mis võimaldab kiasme täpselt loendada. Kiasmide arv on proportsionaalne kromosoomide pikkusega. Ristsiire on toimunud enne, kui kiasmid nähtavale ilmuvad. Katseliselt on seda tõestatud viisil, kus rakke on mõjutatud temperatuurishokiga (kuumashokk) profaasi erinevatel etappidel. Kui mõjutada rakke alles profaasi lõpus, kiasmide ilmumise ajal, on mõju rekombinatsioonisagedusele väike. Kromatiidide katkemise ja ühinemisega kaasneb ka limiteeritud DNA süntees. Seda DNA sünteesi on võimalik tuvastada profaasi esimeses osas, ammu enne seda, kui ilmuvad nähtavale kiasmid. Seega kujutavad kiasmid varem toimunud vahetuse jälgi, kromatiidid on nendest kohtadest üksteisesse takerdunud. Alles homoloogiliste kromosoomide jaotumisel raku ekvatoriaaltasapinnale nad vabanevad.

 

Kromosoomide kaardistamine

 

Ristsiirete arv võimaldab mõõta geneetilist distantsi

 

Homoloogiliste kromosoomide vahelisi ristsiirdeid toimub lühikese distantsi ulatuses harvemini kui pikemate distantside puhul. Iga üksiku raku kohta on ristsiirde toimumise võimalus harv, kuid paljudest rakkudest koosnevas populatsioonis on selleks palju võimalusi. Seega saame me anda keskmise arvulise väärtuse igas konkreetses kromosoomi regioonis toimuvate ristsiirete kohta. Kahe punkti vaheline kaugus kromosoomi geneetilisel kaardil kujutab nende punktide vahel toimuvate ristsiirete keskmist arvu.

 

Selleks, et seda definitsiooni lahti mõtestada, kujutame ette näiteks saja munaraku valmimist meioosis. Kõik need gameedid sisaldavad kromosoome, milles on toimunud kas null (15 gameeti), üks (60 gameeti), kaks (15 gameeti) või kolm ristsiiret (10 gameeti) punktide (geenide) A ja B vahel. Meid huvitab geneetiline distants nende punktide vahel. Selleks arvutame keskmise ristsiirete hulga kromosoomide kohta:

 

0 x (15/100) + 1 x (60/100) + 2 x (15/100) + 3 x (10/100) = 1,2    

 

Kahe aheldunud geeni kaardistamine

 

Metsiktüüpi emaseid äädikakärbseid ristati homosügootsete isastega, kes kandsid kahte autosoomset mutatsiooni – vestigal (vg), mis põhjustas tiibade rudimenteerumist ning black (b), mis põhjustas musta kehavärvust. Meid huvitab geenide vg ja b vaheline distants. F1 põlvkond oli fenotüübilt metsiktüüpi, pikkade tiibade ja halli kehaga, mis kinnitas, et metsiktüüpi alleelid olid dominantsed. F1 põlvkonna emaseid ristati uuesti musta kehaga ja rudimenteerunud tiibadega homosügootsete isastega. 1000-st analüüsitud F2 põlvkonna isendist sarnanesid 820 fenotüübilt vanematega ning 180 olid rekombinantsed (92 halli keha ja rudimenteerunud tiibadega ning 88 musta keha ja pikkade tiibadega). Seda, et geenid vestigal ja black olid aheldunud, tõendab see, et rekombinante oli tunduvalt vähem kui 50% kogu järglaskonnast. Selleks, et määrata nende geenide vahelist distantsi, peame me leidma keskmise ristsiirete arvu F1 põlvkonna emaste gameetides. Selleks arvutame F2 põlvkonna rekombinantide sageduse:

 

180 : 1000 = 0,18.

 

Iga rekombinantne järglane sai kromosoomi, kus oli toimunud üks ristsiire uuritavate geenide vahel. Seega oli keskmine ristsiirete arv:

                Mitterekombinandid                            rekombinandid

                (0) x 0,82                 +              (1) x 0,18                 = 0,18.

 

Seega oli ristsiire uuritavate geenide suhtes toimunud keskmiselt 18-l meioosi läbinud kromosoomil 100-st (18%-l). Need geenid on geneetilisel kaardil teineteisest 18 ühiku – sentiMorgani (cM) kaugusel. 1 Morgan (M) = 100 cM.

 

Arvutades rekombinantide tekkesagedusi ning keskmist ristsiirete arvu uuritavate geenide suhtes on võimalik leida ka kolme ja enama geeni vahelist geneetilist distantsi ning koostada selle põhjal kaart.  

 

Rekombinatsioonisagedus ja distantsid geneetilisel kaardil

 

Eelpool kirjeldatud geneetiliste distantside meetod töötab hästi siis, kui geenid asuvad üksteisele suhteliselt lähestikku. Juhul, kui nad paiknevad üksteisest väga kaugel, ei kajasta rekombinatsiooni sagedus nende tegelikku distantsi. Näiteks geenid cs ja f on äädikakärbse X kromosoomis teineteisest 66,8 cM kaugusel. Samas ei saa kahe geeni rekombinatsiooni sagedus teoreetiliselt ületada 50%. Nii tuleks nad kaardil paigutada teineteisest 50 cM kaugusele. Tänu nende kahe geeni vahele jäävate geenide vaheliste distantside summeerimisele saame distantsiks 66,8 cM. Seega võib tõeline geneetiline distants kahe geeni vahel olla teoreetilisest suurem. Suuremate vahemaade puhul võib toimuda kahe kromatiidi vahel topeltristsiire, nii et lõpptulemusena taastub algne olukord. Sama efekti annab ka neljakordne ristsiire. Kuna sel juhul ei ole kromosoomid rekombinantsed, jäävad need sündmused arvutustest välja. Kokkuvõtvalt võib öelda, et geenidevaheline rekombinatsiooni sagedus, mis jääb allapoole 20 – 25%, kajastab nendevahelist distantsi täpselt, üle selle ilmnevad kõrvalekalded tegelikust olukorrast – tegelik vahemaa on teoreetilisest pikem, kuna osa mitmekordseid ristsiirdeid ei vii lõpptulemusena rekombinantsete kromosoomide moodustumisele ja jäävad arvutustest välja.

 

Kiasmide sagedus ja geneetiline distants

 

Iga homoloogiliste kromosoomide vahel jälgitav kiasm meioosi profaasis peaks kajastama üht profaasi algusosas toimunud ristsiiret. Seega peaks kiasmide loendamine võimaldama meil samuti määrata keskmist ristsiirete arvu kromosoomi kohta. Liidame kiasmid kokku ja jagame uuritud rakkude arvuga. Kui näiteks 100 raku kohta loendati 215 kiasmi, siis keskmine kiasmide arv raku kohta on 2,15 ning kromatiidi kohta poole väiksem – 1,07. Sellest leiame, et kromosoomi pikkus on 107 cM, sest kiasmide arv kromatiidi kohta väljendab kromosoomi geneetilist pikkus. Võime arvutada ka geneetilise pikkuse ja keskmise kiasmidevahelise arvu suhte, see on:

107 cM : 2,15 kiasmi = 50. See tähendab, et geneetilise kaardi 50 cM-le vastab üks kiasm.

 

Geneetiline ja füüsiline distants

 

Me eeldame, et pikemate kromosoomide vahel toimub rohkem ristsiirdeid kui lühemate vahel. Enamasti see nii ongi, kuid mõnede regioonide vahel toimub ümberkombineerumine sagedamini kui teiste vahel. Seega ei vasta kaugused geneetilisel kaardil täpselt kaugustele kromosoomi füüsilisel kaardil. Ümberkombineerumine toimub väiksema tõenäosusega kromosoomi otste lähedal ning tsentromeeri piirkonnas. Need piirkonnad on geneetilisel kaardil kokku surutud. Ülejäänud regioonid, kus ristsiirete toimumise tõenäosus on kõrgem, on geneetilisel kaardil välja venitatud. Hoolimata neist erinevustest on nii geneetilised kui ka füüsilised kromosoomikaardid kolineaarsed, mis tähendab seda, et konkreetsed geenid on mõlemal kaardil samas järjekorras. Seega võimaldab rekombinantide analüüs määrata geenide järjekorda kromosoomis, kuid mitte nendevahelisi füüsilisi kaugusi.

 

Rekombinatsiooni osa evolutsiooniprotsessis

 

Meioosis, kus homoloogilised kromosoomid satuvad kõrvuti, rekombineeruvad aheldunud geenid ristsiirde kaudu – nii tekivad uued alleelide kombinatsioonid. Mõned neist kombinatsioonidest võivad organismile kasulikud olla, tõstes tema eluvõimet ja viljakust. Nii levivad kasulikud kombinatsioonid populatsioonis, kuni muutuvad konkreetse liigi seisukohalt standardseteks. Geneetilise materjali ümberkombineerumine meioosiprotsessis on seega üks viis suurendada geneetilist variantsust, mis on alusmaterjaliks evolutsioonile.

 

Võrdleme kahte liiki, millest üks paljuneb sugulisel teel ning teine mitte. Oletame, et mõlemal liigil tekib kasulik mutatsioon ning aja jooksul veel teinegi. Liigi puhul, mis paljuneb seksuaalsel teel, võivad need mutatsioonid sattuda samasse organismi ja sugurakkude moodustumisel meioosi käigus rekombineeruda. Rekombinantsed järglased on võrreldes üksikmutantidega edukamad ning saavutavad mõne aja pärast populatsioonis ülekaalu. Nii levivad mõlemad kasulikud mutatsioonid populatsioonis koos. Mittesugulisel teel paljuneva organismi puhul puudub võimalus kasulike mutatsioonide rekombineerumiseks ning edasiseks kooslevimiseks populatsioonis.

 

Rekombinatsiooni allasurumine inversioonide teel

  

Kui üks homoloogilistest kromosoomidest sisaldab inversiooni, on rekombineerumine häiritud. Kui siiski ümberkombineerumine inverteerunud osade vahel on toimunud, lähevad rekombinantsed kromatiidid kergemini kaotsi. Näiteks üks rekombinantidest sisaldab kahte tsentromeeri ja teisel tsentromeere pole. Sel juhul rebitakse meioosi anafaasis esimene neist puruks, kuna erinevad tsentromeerid tõmbavad teda erinevatele poolustele, teine ei liigu aga kuhugi. Isegi, kui rekombinantsetel kromosoomidel õnnestub püsima jääda, on nad aneuploidsed – mõned geenid neis on topelt, mõned puudu. Tavaliselt on see organismile letaalne.

 

Rekombinatsioonide supresseerimist inversioonide kaudu kasutavad geneetikud erinevate geenide alleelide koos hoidmiseks samas kromosoomis. Inversiooniga kromosoome on sageli kasutatud katsetes äädikakärbestega. Tavaliselt sisaldab inversiooniga kromosoom dominantset mutantset alleeli, et see kromosoom oleks jälgitav läbi erinevate ristamiskatsete. Selliseid markeeritud inversiooniga kromosoome nimetatakse paigalhoidjateks (ingl. keeles balancers).

 

 

Rekombinatsiooni geneetiline kontroll

 

Rekombinatsiooniprotsessi erinevatel etappidel osalevad paljude erinevate geenide poolt kodeeritud valgud. Huvitaval kombel ei toimu geneetilist ümberkombineerumist ristsiirde teel isastel äädikakärbestel, mis muudab nad võrreldes teiste organismidega unikaalseks. Ka liigiti on rekombinatsioonisagedus erinev.

 <tagasi

9. Aheldumise geneetiline analüüs, kasutades täiustatud meetodeid

 

Aheldumise uurimine katseorganismides

 

Kõige intensiivsemalt on uuritud geenide aheldumist seentel (eriti pärmidel) ning äädikakärbsel.

 

Tetraadanalüüs seentel

 

Askomütseetidele, kuhu kuulub ka pagaripärm Saccharomyces cerevisiae, on iseloomulik, et meioosis moodustunud 4 askospoori jäävad kokku moodustisse, mida nimetatakse askuseks. Kuna need seened on suurema osa oma elutsüklist haploidsed, areneb igast askospoorist uus organism. See lihtsustab erinevate genotüüpidega askospooride fenotüübilist analüüsi.

Askospooride moodustumine pagaripärmil kajastab toimunud meioosiprotsessi. Meioosi lõpptulemusena tekib 4 askospoori, millest igaüks sisaldab ühte neljast meioosi algfaasis kõrvuti paiknenud tetraadi moodustanud kromatiidist. Tänu sellele saame me geenide aheldumist tetraadis uurida askospooride fenotüüpide kaudu.

 

Kui ristata kahte pärmi tüve, millest üks kannab mitteaheldunud mutantseid geene a ja b ning teine nende geenide metsiktüüpi alleele A ja B, siis moodustuvad kolme tüüpi askused. Üks põhitüüpidest sisaldab askospoore, millest kaks on iseloomulikud ühele (AB) ja kaks teisele vanemale (ab) – vanemtüüpi kahetüübiline (parental ditype) askus. Teine põhitüüp sisaldab kahte tüüpi askospoore, mis on rekombinantsed (Ab) või (aB). Mõlemal juhul on üks alleel pärit ühelt vanemalt ning teine alleel teiselt vanemalt  – mitte vanemtüüpi kahetüübiline (nonparental ditype) askus. Kuna erinevad kromosoomid lahknevad üksteisest sõltumatult, moodustub mõlemat tüüpi askuseid võrdselt. Vähesel hulgal moodustub ka kolmandat tüüpi askuseid, mis sisaldavad nelja erinevat tüüpi askospoori (Ab), (ab), (AB) ja (aB) – tetratüüpi askus. Sel juhul on ühe geeni kaks alleeli ristsiirde teel vahetanud oma asukoha.

 

Kui ristata kahte pärmi tüve, kus mutatsioonid paiknevad samas kromosoomis, siis ootame, et enamus askuseid sisaldavad askospoore, mis sarnanevad nende vanematele. Rekombinantsed spoorid tekivad ainult ristsiirde tagajärjel. Kui on toimunud üks ristsiire, moodustub tetratüüpi askus. Kui on toimunud kahekordne ristsiire, sõltub tulemus sellest, mitu kromatiidi selles osalesid – kui vahetus toimus kahe kromatiidi vahel, moodustub askus, kus spoorid sarnanevad vanematega (parental ditype), kui vahetus toimub kolme kromatiidi vahel, on tulemuseks tetratüüpi askus, kui aga vahetus toimub nelja kromatiidi vahel, on askuses kahte tüüpi rekombinante (nonparental ditype). Viimast tüüpi askuseid moodustub võrreldes teistega oluliselt vähem, mis kinnitab omakorda, et vaatlusalused geenid on aheldunud.

 

Pärast seda, kui me oleme määranud aheldumise, on võimalik arvutada geenidevaheline geneetiline distants. Teeme seda konkreetse näite alusel. Ristame kahte pärmitüve, millest üks on mutantne (py – vajab kasvuks püridoksiini; th – vajab kasvuks tiamiini) ning teine metsiktüüpi (PY TH). Diploidsed rakud jagunevad meioosi teel ning moodustuvad askused. 100 erineva askuse analüüsil selgus, et uuritavad geenid on aheldunud, sest võrreldes tetratüüpsete (kokku 44) ja vanemtüüpi ditüüpi askustega (52) oli mittevanemtüüpi (nonparental) ditüüpi askuseid oluliselt vähem (4). Selleks, et arvutada geenidevahelist distantsi, tuleb leida keskmine ristsiirete arv kromosoomi kohta.

 

                Rekombinatsioonisagedus = [(1/2) T + NPD]/ askuste arv,

 

kus T = tetratüüpi askuste arvuga ning NPD = mittevanemtüüpi ditüüpi askuste arvuga. T on korrutatud ½-ga sellepärast, et ainult pooled askospoorid tetratüüpi askustes on geneetiliselt rekombinantsed. Konkreetne rekombinatsiooni sagedus on seega:

 

[(1/2)(44) + 4]/100 = 0,26. Geneetiline distants on 0,26 Morganit = 26 cM. Kuna rekombinatsioonisagedus ületas 25%, on tegelik distants pikem, arvestamata jäid mõned kahekordsed ristsiirded. Sellepärast eelistavad osa teadlasi kasutada valemit

 

                Geneetiline distants = [(1/2) T + 3 NPD]/ askuste arv

Seda valemit kasutades leiame, et geneetiline distants geenide py ja th vahel on 34 cM.

Tetraadanalüüs seenega Neurospora crassa on veelgi informatiivsem, sest askospoorid askuses jäävad kindlasse ritta, kajastades olukorda, kuidas külgnesid meioosis üksteisega neli kromatiidi.

 

“Paigalhoidvate” kromosoomide (balancer chromosomes) kasutamine Drosophila geneetilises analüüsis

 

Uute mutatsioonide lokaliseerimiseks kromosoomis kasutatakse dominantse alleeliga markeeritud inversiooniga kromosoome, nn. paigalhoidvaid (balancer) kromosoome, mis takistavad nende kromosoomide rekombineerumist normaalsete (inversioonita) homoloogidega.

 

Analüüsime ristamise tulemusi, kus on kasutatud kahte paigalhoidvat kromosoomi – kromosoom number 2 on markeeritud dominantse mutatsiooniga Cy (krussis tiivad – ingl. k. curly wings) ning kolmas kromosoom on markeeritud mutatsiooniga Tb (jässakas keha – ingl. k. tubby body). Homoloogilised kromosoomid kannavad samuti dominantseid markereid – Pm (ploomivärvi silmad – ingl. k. plum eyes) teises kromosoomis ning Sb (tüükakujulised harjased – ingl. k. stubble bristles) kolmandas kromosoomis. Kõigil neljal markeril on ka retsessiivne letaalne efekt, mistõttu homosügoodid surevad. Tundmatu retsessiivse mutatsiooni suhtes homosügootseid emaseid ristatakse isastega, kes kannavad eelpoolkirjeldatud tasakaalustavaid kromosoome ja nende homolooge. Sõltuvalt sellest, millises kromosoomis uuritav mutatsioon paikneb, on järglaskond erinev. Kui mutatsioon on X-liiteline, on kõik isased järglased mutantsed, emased aga mitte. Tasakaalustavaid kromosoome poleks analüüsiks vaja olnudki. Juhul, kui mutatsioon paikneb ühes autosoomidest, ristatakse F1 heterosügoote omavahel ja analüüsitakse siis tulemusi. Hindame erinevaid võimalusi:

1.        Mutatsioon paikneb teises kromosoomis. Kuna teine paigalhoidev kromosoom sisaldas markerit cy, ei saa tekkida rekombinante, mis oleksid fenotüübilt mutantsed ja krussistiivalised, kuna retsessiivset mutantset alleeli sisaldav kromosoom ei saa inversiooni tõttu selle kromosoomiga rekombineeruda

2.        Mutatsioon paikneb kolmandas kromosoomis. Kuna kolmas paigalhoidev kromosoom sisaldas markerit Tb, ei saa tekkida rekombinante, mis oleksid fenotüübilt mutantsed ja jässaka kehaga.

3.        Mutatsioon paikneb neljandas kromosoomis. Mõned järglased on samaaegselt nii mutantsed, krussistiivalised kui ka kehalt jässakad.

 

Spetsiaalsed kaardistamise meetodid

 

Neurospora crassa reastatud tetraadide analüüs tsentromeeride kaardistamiseks

 

Neurospora crassa on haploidne seen, kes moodustab pikki rakkude filamente, mida nimetatakse mütseeliumiks. Seda seent teatakse ka leivahallitusena. Erinevatesse ristamistüüpi kuuluvad haploidsed rakud võivad ühineda ning diploidne rakk läbib meioosi. Iga askospoor saab ühe neljast kromatiidist. Erinevalt pärmist on Neurospora’l askospooride kott piklik ja väga kitsas, nii et spooride reastumine askuses kajastab seda, kuidas reastusid kromatiidis meioosis. Meioosi käigus rakud ei pooldu, tuumad jäävad kõrvuti ning pärast meioosi toimub veel üks mitootiline jagunemine, nii et iga haploidne tuum jaguneb veel omakorda. Lõpptulemuseks on kaheksa reas paiknevat tuuma, mis eraldatakse üksteisest rakuseintega, nii et moodustuvad askospoorid. Ettevaatliku manipuleerimise tulemusena on võimalik reas paiknevad spoorid ükshaaval askusest eraldada ja uurida nende fenotüüpi.

 

Oletame, et alleelid A ja a, mis paiknevad tsentromeeri lähedal, produtseerivad askospoorides erinevaid pigmente. Kui ristata A ja a alleelidega rakke, moodustuvad kaheksa spooriga askused. Alleelid võivad segregeeruda erinevalt ja seetõttu näeme kahetüübilisi askuseid.

Esimesel jagunemisel segregeerumise muster avaldub siis, kui neli esimest spoori askuses on alleeliga A ja ülejäänud neli alleeliga a. Alleelid A ja a lahknevad esimesel jagunemisel puhtalt – AA ühele poole ja aa teisele poole. Pärast teist jagunemist lahknevad kromatiidid eraldi tuumadesse järjekorras A, A, a, a ning seejärel poolduvad tuumad veel mitootiliselt.

Teisel jagunemise segregeerumise mustrit näeme siis, kui on toimunud ristsiire lookuse A ja tsentromeeri vahelt, ning A ja a satuvad teisel meiootilisel jagunemisel erinevatesse tuumadesse. Sel juhul on reas kahekaupa kõrvuti kord ühte, kord teist alleeli sisaldavad askused. Materjali ümberkombineerumine kahe kromatiidi vahel toimub esimesel meiootilisel jagunemisel, kumbagi tuuma satub üks algne ja üks rekombinantne kromatiid. Pärast teist jagunemist satuvad kõik kromatiidid erinevatesse tuumadesse järjekorras A, a, A, a.

Kuna ümberkombineerumine toimus geeni ja tsentromeeri vahelt, on võimalik arvutada geeni ja tsentromeeri vahelist geneetilist distantsi. Kuna ümberkombineerumine toimus ainult kahe kromatiidi baasil, korrutatakse teisel jagunemisel segregeerumise tüüpi askuste arv 0,5-ga ja jagatakse kogu analüüsitud askuste arvuga. Näiteks mutantse, kasvuks vitamiini tiamiin vajava mutandi (thi-) ristamisel metsiktüüpi tüvega olid 132-st analüüsitud askusest 104 esimesel jagunemisel segregeerumise mustriga ning 28 teisel jagunemisel segregeerumise mustriga. Geeni thi geneetiline distants tsentromeerist on seega (1/2)(28/132) = 10,6 cM.

 

Drosophila deletsioonide ja duplikatsioonide tsütogeneetiline kaardistamine

 

Erinevalt rekombinantide analüüsil põhinevast geenide kaardistamisest on tsütogeneetilise kaardistamise puhul oluline, et uuritav fenotüübilist efekti omav  retsessiivne mutatsioon oleks kombineeritud tsütoloogiliselt jälgitava deletsiooni või duplikatsiooniga. Äädikakärbse polüteenkromosoomide puhul on deletsioonid ja duplikatsioonid kergesti jälgitavad.

Näiteks mutatsioon white on X kromosoomi ühest otsast 1,5 cM kaugusel, kuid kumma otsa suhtes see distants on leitud ning kui kaugele jääb ta otsast füüsiliselt, seda aitab selgitada ainult tsütoloogiline analüüs. Ristamise teel püütakse saada heterosügootseid järglasi, mis kannaksid mutatsiooniga white X kromosoomi ning defineeritud kohast deletsiooniga  X kromosoomi. Juhul, kui teises X kromosoomis olev deletsioon hõlmab white geeni sisaldavat piirkonda, on järglased valgete silmadega, kõigil teistel juhtudel aga punaste silmadega. Põhjus on selles, et kui  deletsioon ja white geen asuvad samas kohas (lookuses), ei ole heterosügootides funktsionaalset metsiktüüpi alleeli ning pigmenti ei produtseerita. Vastava deletsiooni asukoht on jälgitav polüteenkromosoomil.

Ka duplikatsioone saab kasutada mutatsioonide kaardistamisel. Sel juhul jälgime duplikatsiooni, mis maskeerib retsesiivse mutatsiooni fenotüübi, s.t. ta peab sisaldama duplikatsioonis mutantse geeni metsiktüüpi alleeli.

 

 

Geenide aheldumise uurimine inimesel

 

Kuni lähiajani oli inimese geenide kaardistamine üsna komplitseeritud, kuna pole väimalik läbi viia kontrollristamisi. Samuti on analüüsitav järglaskond väga väike. Kõige vanem ja otsesem viis inimese geenide aheldumise analüüsiks on sugupuude analüüs.

 

Geenide aheldatuse tuvastamine sugupuude analüüsil

 

Kõige lihtsam on aheldatust jälgida X kromosoomi korral. Nii on leitud, et nii hemofiiliat kui ka värvipimedust (võimetus eristada punast ja rohelist värvi) põhjustav alleel on aheldunud X kromosoomi. Hemofiiliat võib põhjustada mutatsioon kahes lookuses. Hemofiilia B puhul puudub indiviididel koagulatsiooni faktor IX, hemofiilia A korral aga koagulatsiooni faktor VIII. Faktor VIII-t kodeeriv geen paikneb kromosoomi otsale lähemal, mõlemad geenid paiknevad X kromosoomi pikas õlas.

Mõned sugupuud on võimaldanud jälgida ka autosoomsete mutatsioonide aheldatust. Näiteks võib tuua küünte-kederluu (nail-patella) sündroomi, mis on aheldunud ABO vererühma lookusega. Küünte-kederluu sündroom on harv autosoomne dominantne tunnus, mille puhul küüned  ja põlved on vähe arenenud.

 

Somaatiliste rakkude geneetika – alternatiivne moodus geenide kaardistamisel

 

1.        Rakkude hübridiseerimine. Meetod töötati välja 60-ndatel aastatel Barski ja Ephrussi poolt. Võimalik on liita somaatilisi rakke nii samast liigist kui ka erinevatest liikidest. Liitunud rakke nimetatakse hübriidideks. Meetod on rakendatav ka inimese geenide kaardistamisel. Tavaliselt hübridiseeritakse inimese rakkudega näriliste, näiteks hiirte rakke. Kokkusegatud rakkude liitumist stimuleeritakse kas inaktiveeritud Sendai viirusega või polüetüleenglükooliga. Esmalt liituvad rakumembraanid, seejärel tuumamembraanid. Kui hübriidne rakk jaguneb, lähevad inimese kromosoomid järk-järgult juhuslikkuse alusel kaotsi. Pärast mitmeid rakujagunemisi on hübriidses rakus alles veel ainult üks või väga vähesed inimese kromosoomid. Miks see nii toimub, on seni selgusetu.

 

Isegi, kui katsetingimused on ideaalsed, moodustub väga vähe hübriidseid rakke. Osa rakke ei liitu, palju on ka hiir - hiir ning inimene – inimene liitrakke. Selleks, et töötada edasi tõeliste hübriididega, kasutatakse rakkude kasvatamiseks selektiivset söödet – tavaliselt HAT söödet (hüpoksantiin-aminopteriin-tümidiin). Juhul, kui üks rakutüüpidest on defektne tümidiini kinaasi suhtes (TK-) ja teine näiteks hüpoksantiini fosforibosüül transferaasi suhtes (HPRT-), need rakud söötmel ei kasva. Kasvada saavad üksnes hübriidid. HAT söötmes olev aminopteriin blokeerib tavalise puriinide ja tümidülaadi sünteesiraja, mistõttu rakud saavad kasvada ainult siis, kui neis on funktsionaalsed TK ja HPRT alleelid ning söötmes tümidiin ja hüpoksantiin. Kui hübriidsed rakud on selekteeritud, isoleeritakse kloonid e. rakuliinid (tegemist on ühe raku järglaskonnaga). Iga rakuliini puhul jälgitakse, milliseid valke sünteesitakse ning milliste valkude puudumine/olemasolu on seotud konkreetse inimese kromosoomi puudumise/olemasoluga. Üks hübriidne liin sisaldas ainult ühte inimese kromosoomi – 17-ndat kromosoomi ning oli sellegipoolest võimeline sünteesima tümidiini kinaasi. Seega paigutus TK geen 17-ndasse kromosoomi. Vastupidisel rakkude hübridiseerimisel (HPRT- hiire rakud + TK- inimese rakud) saadi HAT- söötmel kasvav hübriid, mis sisaldas inimese kromosoomidest ainult X kromosoomi. See näitas, et geen HPRT paikneb X kromosoomis. 

 

Somaatiliste rakkude hübridiseerimist saab kasutada peaaegu kõigi inimese geenide kaardistamisel. Oluline on vaid see, et hübriidses rakus konkreetne geen avalduks ning et ta oleks eristatav hiire vastavast geeniproduktist. Näiteks UMP kinaasi geen lokaliseeriti esimesse kromosoomi. Inimese ja hiire UMP kinaase on võimalik eristada geelelektroforeesiga. Valkude aminohappelises järjestuses on mõned erinevused ja see kajastub nende ensüümide erinevas liikuvuses geelelektroforeesil. Kui analüüsiti erinevaid hübriidseid rakuliine, siis oli inimese UMP kinaas alati esindatud ainult nende hübriidide korral, mis sisaldasid esimest inimese kromosoomi.

Tänapäeval kasutatakse inimese geenide tuvastamiseks hübriidsetest rakkudest enamasti spetsiifilise DNA detekteerimise meetodeid (nukleiinhapete hübridisatsioon, PCR).

 

2.        Geenide kaardistamine kasutades kromosomaalseid ümberkorraldusi. Hübriidsete rakkude analüüs võimaldab tuvastada, millises kromosoomis uuritav geen paikneb, kuid sel juhul jääb selgusetuks, millises kromosoomi piirkonnas. Seetõttu võetakse appi kombineeritud meetodid, kasutades geneetiliste ümberkorraldustega kromosoome, mis sisaldavad translokatsioone. Näiteks on toimunud translokatsioon X kromosoomi ja 14-nda kromosoomi vahel – enamus X kromosoomi pikast õlast on translokeerunud 14-nda kromosoomi otsa ning väike segment 14-nda kromosoomi otsast on translokeerunud X kromosoomi otsa. Inimese rakke, mis seda translokatsiooni sisaldasid, hübridiseeriti hiire rakkudega ja kasvatati HAT-söötmel. Mõned ellujäänud hübriidsed rakud sisaldasid lisaks hiire kromosoomidele ainult üht inimese kromosoomi – 14-ndat kromosoomi, kuhu oli liitunud enamus X kromosoomi pikemast õlast. Kuna eelnevalt oli teada, et geen HPRT paikneb X kromosoomis, oli nüüd selge, et see geen paikneb X kromosoomi pikemas õlas. Need hübriidsed rakud ekspresseerisid ka fosfoglütseraadi kinaasi (PGK) ning glükoos-6-fosfaadi dehüdrogenaasi (G6PD), mille geenid olid samuti eelnevalt X kromosoomi lokaliseeritud. Järelikult sai nüüd ka nende kahe geeni täpsem asukoht selgeks. Sama rakuliin ekspresseeris ka nukleosiidi fosforülaasi (NP), mille geeni kohta oli eelnevalt teada, et see paikneb 14-ndas kromosoomis. Seega sai nüüd välistada võimaluse, et NP-d kodeeriv geen paikneb 14-nda kromosoomi selles osas, mis oli translokeerunud X kromosoomi. Edasise analüüsi käigus töötati juba selliste translokatsiooni sisaldavate kromosoomidega, kus X kromosoomist olid üle kandunud lühemad segmendid. Nii oli võimalik uuritavad geenid X kromosoomis reastada.

 

X kromosoomis paikneb ka geen DMD, mille defektsus avaldub Duchenne lihaselise düstroofia näol. DMD on neuromuskulaarne haigus, mille sümptomid ilmnevad tavaliselt alates 6-ndast eluaastast. 12-ndaks eluaastaks jõuavad patsiendid ratastooli ning ei ela üle 20-nda eluaasta. Enamasti esineb DMD meestel, kuna see on X-liiteline retsessiivne haigus ning patsiendid ei  ela nii kaua, et defektseid geene järgmisesse põlvkonda edasi anda. Siiski on ka üksikuid naissoost haigeid. Haiged naised kandsid kõik X kromosoomi, millest oli toimunud translokatsioon autosoomi. Kuigi autosoomid varieerusid, oli X kromosoomi katkemiskoht kõigil juhtudel regioonis, mis sisaldas DMD geeni. Naistel on üks X kromosoomidest rakkudes inaktiveeritud. Pooltes rakkudes on inaktiveeritud üks homoloogidest, pooltes teine. Translokatsiooniga X kromosoomi puhul aga inaktiveerus eelistatult normaalne X kromosoom.

3.        Deletsioonide analüüs. Mõnikord läheb fragment kromosoomist lihtsalt kaotsi, deleteerub. Kui sel juhul ilmnevad indiviidil muutused fenotüübis, näiteks põeb ta mingit haigust, võimaldab deletsioon lokaliseerida geene, mille defektsus seda haigust põhjustab. Näiteks harvaesineva X kromosoomist toimunud deletsiooniga kaasnevad nähud kinnitasid, et DMD geen paikneb X kromosoomi lühemas õlas. Suhteliselt väikese deletsiooniga X kromosoomi väikesest õlast (Xp21) kaasnesid Duchenne lihaselise düstroofiaga veel sellised haigused nagu krooniline granulomatoos (CGD) - immunoloogiline haigus, millega kaasneb tsütokroom b defitsiit; retinis pigmentosa (RP) – puudulik nägemine ja McLeodi haigus, mille puhul on kahjustatud punased vererakud. Seega lokaliseerusid kõik neli eelpool kirjeldatud haigustega seotud geeni sinna küllaltki kitsasse regiooni. Edasi muutus võimalikuks konkreetsed geenid juba isoleerida. DMD  geeni isoleerimise detailidest tuleb juttu hiljem.

 

4.        Duplikatsioonide analüüs. Duplikatsiooni puhul on geeni poolt kodeeritud valgu hulk rakus kõrgem, see võib väljenduda kõrgenenud ensüümiaktiivsuses. Duplikatsioonide analüüsiks kasutatakse sageli translokatsioonidega kromosoome. Sel põhimõttel lokaliseeriti ka GOTs (glutamic oxaloacetic transaminase) geen. Eelnevate analüüside põhjal oli teada, et geen GOTs peaks paiknema 10-nda kromosoomi pikema õla distaalses segmendis.  Geeni lokaliseerimiseks kasutati kolme erinevat hübriidsete rakkude liini. Esimeses rakuliinis sisaldus kaks koopiat 10-ndast, 17-ndast ja 21-st kromosoomist, kusjuures ühte 17-ndasse kromosoomi oli translokatsiooni tulemusena sattunud segment 10-nda kromosoomi otsast. Ka teine rakuliin sisaldas kahte 10-ndat, 17-ndat ja 21-st kromosoomi, kuid sel juhul oli translokatsioon 10-nda kromosoomi pikast õlast toimunud 21-sse kromosoomi. Mõlemas rakuliinis oli seega lisakoopia 10-nda kromosoomi segmendist. Kolmas rakuliin oli kontrolliks ning sisaldas kahte 10-ndat, 17-ndat ja 21-st kromosoomi. Erinevatest rakuliinidest määrati GOT ensüümi aktiivsust. Selgus, et teises rakuliinis, mis sisaldas 10-nda kromosoomi segmendi translokatsiooni 17-ndasse kromosoomi, oli ensüümiaktiivsus kõrgem. Kuna ensüümiaktiivsuse tasemed kontrollrakuliinis ja translokatsiooni 21-sse kromosoomi sisaldavas rakuliinis olid omavahel võrreldavad, õnnestus geen lokaliseerida kitsasse piirkonda, mis oli translokeerunud 17-ndasse kromosoomi, kuid mitte 21-sse kromosoomi.

 

Inimese geneetiline kaart

 

80-ndate aastate lõpul käivitati inimese genoomi projekt HUGO (Human Genome Project) mille peamiseks eesmärgiks on konstrueerida iga kromosoomi detailne kaart. Esmalt kaardistatakse konkreetsed segmendid, seejärel leitakse nende asukohad kromosoomides ning lõpuks määratakse nende segmentide nukleotiidne järjestus. Praeguseks on määratud inimese kogu genoomi nukleotiidne järjestus 99% täpsusega. Paljude seniseks iseloomustatud geenide puhul on leitud, et mutatsioonid neis geenides on seotud kas mingi haigusega või geneetilise defektiga. Märksa raskem on aga konkreetseid geene seostada selliste normaalse muutlikkusega tunnustega nagu kasv, kaal, naha pigmentatsioon, juuste värvus, vastupanu haigustele.

(Neil, kellel on soov inimese genoomi kaardistamise kohta rohkem lugeda, soovitan tutvuda internetis oleva Geneetika 2 konspektiga osas, kus on käsitletud genoomi uuringuid) 

 

<tagasi

 

10. DNA ja kromosoomide molekulaarne struktuur 

 

1868. aastal isoleeris Johann Friedrich Miescher rakkudest happelise ühendi ning nimetas selle nukleiiniks. Võrreldes teiste rakust eraldatud komponentidega oli see ühend ebatavaline oma kõrge lämmastiku ja fosfori sisalduse poolest. 1871. aastal need andmed ka publitseeriti, kuid nukleiinhappe rolli geneetilise informatsiooni kandjana mõisteti alles aastakümneid hiljem.

 

Tõendid selle kohta, et geneetiline informatsioon sisaldub DNA-s

 

Kromosoomid koosnevad 2 tüüpi makromolekulidest - valkudest ja nukleiinhapetest. Nukleiinhape võib olla kas DNA (desoksüribonukleiinhape) või RNA (ribonukleiinhape). Enamuse organismide puhul on geneetiline informatsioon kodeeritud DNA nukleotiidse järjestuse poolt. Erandiks on mõned RNA viirused, mille genoomiks on RNA molekul. Viiruste eripäraks on veel see, et kui teiste organismide genoomiks on kaksikahelaline DNA, siis mõnede DNA viiruste genoomiks on üksikahelaline DNA. Ka RNA viiruste genoomiks võib olla kas üksikahelaline või kaksikahelaline RNA.

 

Kaudsed tõendid selle kohta, et geneetilist informatsiooni säilitatakse DNA-s

 

Eukarüootidel paikneb DNA rakutuumas, kromosoomides, enamus valke ja RNA-d aga tsütoplasmas. Kui DNA on sama organismi rakkude piires kõikjal ühesuguse molekulaarse koostisega, siis RNA ja valgumolekulide poolest on varieeruvus suur, sest erinevates rakutüüpides avalduvad geenid erinevalt. Võrreldes RNA-ga on DNA tunduvalt stabiilsem, kuna geneetiline materjal peab säiluma ja kanduma vanematelt järglastele.

 

Otsesed tõendid selle kohta, et geneetiline informatsioon sisaldub DNA-s, on saadud järgmiste katsetega:

 

1.        Bakterite transformatsiooni põhjustab DNA

2.        Bakteriofaagi T2 geneetiline informatsioon sisaldub DNA molekulis

 

Bakterite transformatsiooni avastamine

 

Transformatsioon on geneetilise informatsiooni ülekandumine ühest bakterirakust teise rakust isoleeritud DNA abil. Transformatsioon võib toimuda ka looduslikes tingimustes. Sel juhul kandub elusrakkudesse surnud rakkudest vabanenud DNA.

 

Streptococcus pneumoniae (pneumokokk) on patogeenne bakter, mis võib põhjustada kopsupõletikku. Pneumokokid on geneetiliselt muutlikud, mis avaldub nende fenotüübis. Üheks silmatorkavaks tunnuseks on polüsahhariididest koosneva limakapsli olemasolu. Patogeensed on ainult limakapsliga pneumokokid, sest limakapsli tõttu ei suuda peremeesorganism neid hävitada. Kapsli olemasolu või puudumist on võimalik hinnata tardsöötmel moodustuvate bakterikolooniate suuruse alusel. Limakapsliga rakud (S-tüüpi, smooth = sile) moodustavad söötmel suuri, siledapinnalisi kolooniaid, kapslita rakud (R-tüüpi, rough =  kare, konarlik) moodustavad aga väikesi, ebatasase pinnaga kolooniaid. Hiirte süstimisel S-tüüpi rakkudega hiired surid, R-tüüpi rakkudega süstimisel aga jäid ellu. 1928. a. demonstreeris Frederick Griffith, et hiired surid ka siis, kui neid süstiti seguga, mis sisaldas R tüüpi elusaid rakke ning S-tüüpi surmatud rakke. Kapslita rakud omandasid surnud rakukultuurist midagi, mis muutis - transformeeris - nad patogeenseteks kapsliga rakkudeks, võimaldades neil selle tulemusena hiire immuunsüsteemile vastu seista.

 

1944. a. näitasid Oswald Avery, Colin MacLeod ja Maclyn McCarty, et Streptococcus pneumoniae avirulentsete R-tüüpi rakkude transformeerumist S-tüüpi virulentseteks rakkudeks põhjustas DNA. Nad isoleerisid S-tüüpi pneumokokkidest DNA. Kuna DNA preparaat võis sisaldada ka RNA-d ja valke, töötlesid nad seda erinevate ensüümidega, mis degradeerisid valikuliselt kas DNA (DNaasid), RNA (RNaasid) või valgud (proteaasid) ning uurisid töödeldud preparaadi võimet transformeerida R-tüüpi rakke virulentseteks. Selgus, et transformatsioonivõime oli kaotanud ainult see preparaat, mida oli töödeldud DNaasiga. Järelikult osutus geneetilise informatsiooni kandjaks DNA.

 

Tõendid selle kohta, et bakteriofaagi T2 geneetiline informatsioon on talletatud DNA-s

 

Lisatõendid selle kohta, et geneetilise informatsiooni kandjaks on DNA, avaldasid 1952. a. Alfred Hershey ja Martha Chase. Viirused on rakusisesed parasiidid, kelle elutegevus sõltub täielikult peremeesraku valgusünteesiaparaadist ja energiat genereerivatest süsteemidest. Erinevad viirused paljunevad erinevat tüüpi rakkudes. Bakterirakke nakatavaid viiruseid nimetatakse bakteriofaagideks e. faagideks. Bakteriofaagi genoom (DNA molekul) on pakitud valkkattesse. Hershey ja Chase näitasid, et kui viirus nakatab bakterirakku, jäävad valgud raku pinnale ning rakku siseneb ainult DNA. Seega sisaldub geneetiline informatsioon viiruse taastootmiseks DNA molekulis. DNA-d ja valke on võimalik valikuliselt märkida radioaktiivsete isotoopidega ja hinnata seejärel, kuhu radioaktiivselt märgistatud molekulid pärast jäävad. DNA-d märgistatakse fosfori radioaktiivse isotoobiga 32P ning valke väävli radioaktiivse isotoobiga 35S. Selleks, et märgistada  faagi T2 valke ja DNA-d, kasvatasid Hershey ja Chase faagiga nakatatud bakterirakke söötmel, mis sisaldas normaalsete väävli või fosfori isotoopide asemel radioaktiivseid. Nii paljundati rakkude kasvatamisel 35S sisaldaval söötmel faagi, kus radioaktiivselt olid märgistatud valgud, DNA aga mitte. Kui söötmesse oli lisatud 32P, kuid mitte radioaktiivne väävel, sisaldasid paljunemistsükli läbinud faagipartiklid radioaktiivselt märgistatud DNA-d ja valkudesse radioaktiivsust ei lülitunud. Viidi läbi 2 paralleelkatset:

1)       35S-ga märgistatud T2 partiklitega nakatati E. coli rakke mõne minuti vältel. Seejärel viidi nakatatud rakukultuur segistisse (blender) ning tsentrifuugiti rakud põhja. Enamus radioaktiivsusest jaotus rakupinnalt vabanenud faagi valkude koostises supernatanti.

2)       32P-ga märgistatud T2 partiklite puhul viidi läbi sama protseduur. Sel juhul jäi enamus radioaktiivsust pärast rakkude põhjatsentrifuugimist rakkudesse.

 

Need katsed kinnitasid, et rakkudesse sisenes faagi T2 DNA, mitte aga valguline komponent.

 

Tänapäevaks on välja töötatud meetodeid, mis võimaldavad rakkudesse viia eelnevalt puhastatud viiruse DNA-d. Vastavat protseduuri nimetatakse transfektsiooniks.

 

Tõendid selle kohta, et mõnede viiruste geneetiline informatsioon on salvestatud RNA molekuli

 

Tubaka mosaiigiviiruse (TMV) genoomiks on RNA molekul. TMV partiklite komponendid (valgumolekulid ja RNA) on võimelised ise assambleeruma, mille tulemusena moodustuvad infektsioonivõimelised viiruspartiklid. 1957. a. avaldas Heinz Fraenkel-Conrat kolleegidega rekonstitutsioonikatse tulemused. Ühe viirustüve RNA ja valgu molekulid segati teise viirustüve RNA ja valgu molekulidega, lasti partiklitel assambleeruda ning seejärel nakatati taimelehti. Järgmise põlvkonna viiruspartiklid olid nii oma genotüübilt kui ka fenotüübilt alati identsed selle viirustüvega, millelt pärines RNA.

 

DNA ja RNA struktuur

 

Nukleiinhape (DNA või RNA) on polümeer, mis koosneb nukleotiididest. Igas nukleotiidis sisaldub fosfaatrühm, 5-süsinikuline suhkur (pentoos) ja tsükliline lämmastikalus. Kui lämmastikalus on ainult suhkrujäägiga seotud, on tegemist nukleosiididega. Näiteks, kui adeniin on seotud riboosiga, on tegemst adenosiiniga. Ühe või mitme fosfaatrühma kovalentsel sidumisel nukleosiidile saadakse nukleotiid. Näiteks nukleotiid adenosiintrifosfaat (ATP) koosneb adeniinist, riboosist ja kolmest fosfaatrühmast. Kui riboosi asemel on suhkrujäägiks desoksüriboos, saame desoksüadenosiintrifosfaadi. DNA puhul on suhkruks desoksüriboos, sellest ka nimetus - desoksüribonukleiinhape. RNA puhul on suhkruks riboos, mistõttu RNA-d nimetatakse ribonukleiinhappeks. RNA molekul on tavaliselt üksikahelaline polümeer, DNA esineb tavaliselt aga kaksikahelalisena.

 

DNA-s on 4 erinevat lämmastikalust: adeniin (A), guaniin (G), tümiin (T) ja tsütosiin (C). RNA sisaldab tümiini asemel uratsiili (U). A ja G on 2-tsüklilised lämmastikalused - puriinid. T, C ja U puhul on tegemist pürimidiinidega, kus lämmastikuaatomid moodustavad ühe tsükli.

 

 

 

DNA kaksikahela ehitus

 

1953. a.  kirjeldasid James Watson ja Francis Crick DNA ruumilise struktuuri. Mudeli loomisel lähtusid nad järgmisest informatsioonist:

 

1)     Erwin Chargaff kolleegidega analüüsis DNA koostist. Segus, et tümiini kontsentratsioon vastas alati adeniini kontsentratsioonile ja tsütosiini kogus guaniini hulgale. Samuti näitasid nad, et pürimidiinide summaarne kontsentratsioon DNA molekulis vastas kõigil juhtudel puriinide summaarsele kontsentratsioonile. Samas oli molaarne suhe T + A/ C + G liigiti erinev.

 

2)     Maurice Wilkins'i ja Rosalind Franklin'i poolt saadud DNA röntgenstruktuuri analüüsi tulemused. DNA kristallstruktuuri uuringud näitasid, et DNA on 2-ahelaline, kusjuures ümber molekuli telje kordub regulaarselt (iga 0,34 nm järel) teatav alamstruktuur.

 

Watson ja Crick esitasid DNA mudeli, mis hiljem leidis kinnitust ka eksperimentaalselt.

 

DNA on paremalepöörduv 2-ahelaline heeliks. Nukleotiidid polünukleotiidahelas on kovalentselt seotud fosfodiestersidemete kaudu. 2 polünukleotiidahelat on omavahel seotud vesiniksidemete kaudu, mis tekivad lämmastikaluste vahel. Alustevaheline paardumine on spetsiifiline: A paardub T-ga ja G paardub C-ga. Seega koosnevad kõik aluspaarid ühest puriinist ja pürimidiinist. Lämmastikaluste spetsiifilise paardumise määrab ära see, et vesiniksidemed saavad moodustuda ainult kindlate paaride korral. A ja T vahel moodustub 2 vesiniksidet, C ja G vahel 3.

 

Lämmastikaluste spetsiifilisest paardumisest tuleneb DNA ahelate komplementaarsus. Kui ühe DNA ahela nukleotiidne järjestus on teada, on selle põhjal võimalik kirjutada vastasahela nukleotiidne järjestus. Just DNA ahelate komplementaarsus võimaldab geneetilist informatsiooni säilitada ja kanda põlvkonniti edasi.

 

Ühte DNA kaksikheeliksi pöördesse mahub 10 lämmastikaluste kaudu paardunud nukleotiidi. Suhkrus tähistatakse C-aatomeid C1', C2', C3', C4' ja C5'. Fosfodiestersidemed polünukleotiidahelas tekivad sel viisil, et kasvava DNA ahela viimase nukleotiidi suhkru vabale 3'C-OH rühmale lisatakse  nukleosiidtrifosfaat, kus fosfaadid on seotud suhkru 5'C-ga. Suhkru 3'C küljes olev OH-rühm ühineb lisanduva nukleotiidi (nukleosiidtrifosfaadi) suhkru 5'C-ga seotud fosfaadi H-aatomiga ning 3'C ning järgmise nukleotiidi fosfaadi vahele tekib fosfodiesterside. Sideme tekkel eraldub vesi ja vabaneb pürofosfaat (PPi). Nukleiinhapet sünteesitakse 5' otsast 3' suunas. Kuna see on ainuvõimalik DNA ahela sünteesi suund, on DNA ahelad kaksikheeliksis antiparalleelsed. DNA molekuli ühe ahela otsas on vaba 3' OH-rühm, teise ahela otsas aga vaba 5' fosfaat.

 

DNA kaksikheeliks püsib stabiilsena tänu paardunud lämmastikaluste vahel moodustunud vesiniksidemetele. Lisaks stabiliseerivad DNA-d ka külgnevate aluspaaride vahelised hüdrofoobsed sidemed.

 

DNA kaksikheeliksi alternatiivsed vormid

 

Watsoni ja Crick'i poolt esitatud DNA kaksikheeliksi mudel kirjeldab DNA struktuuri, mis vastab B-DNA vormile. Sellises konformatsioonis on DNA füsioloogilistes tingimustes (vesilahuses, milles soolade kontsentratsioon on madal). Seega on elusrakus DNA molekulid tavaliselt B-konformatsioonis. Kui DNA satub kõrge soolsusega keskkonda või ta on osaliselt dehüdreeritud, moodustub A-konformatsioon. A-DNA sarnaneb B-DNA-le, sest ka siis on tegemist paremale pöörduva kaksikheeliksiga, kuid sel juhul on DNA heeliks tihedam - ühte pöördesse mahub 11 paardunud nukleotiidi. DNA heeliksil on eristatavad suur ja väike vagu. A-DNA puhul on väike vagu laiem ja madalam kui B-DNA puhul. Kas A-DNA-l on ka bioloogilisi funktsioone, on seni küsitav, kuid see kaksikheeliksi vorm on huvipakkuv seetõttu, et sarnaneb väga konformatsiooniga, mis tekib DNA-RNA ja RNA:RNA dupleksite puhul. DNA-RNA dupleksite moodustumine on rakkudes sage protsess.

 

DNA puhul on kirjeldatud ka vasakule pöörduvat kaksikheeliksit, mida nimetatakse Z-DNA-ks. Nimetus Z-DNA tuleneb sellest, et selle konformatsiooni puhul paikneb suhkur-fosfaat selgroog sikk-sakiliselt. Z-DNA puhul mahub heeliksi täispöördesse 12 aluspaari ning molekuli pinnal on ainult üks sügav vagu. Z-DNA esineb selliste nukleotiidsete järjestuste puhul, kus üksteisele järgnevad vaheldumisi G:C ja C:G aluspaarid:

 

5'-GCGCGCGCGCGC-3'

3'-CGCGCGCGCGCG-5'

 

Z-DNA tekkimist soodustavad tsütosiini metüleerimine ning DNA negatiivne superspiralisatsioon. Arvatakse, et üks Z-DNA bioloogilisi rolle võib olla seotud transkriptsiooniga.

 

Nukleiinhapete primaar- sekundaar- ja tertsiaarstruktuurid

 

Kui nukleotiidid on omavahel ühendatud DNA või RNA ahelaks, on tegemist DNA või RNA primaarstruktuuriga. Sekundaarstruktuur tekib siis, kui kaks polünukleotiidahelat moodustavad kaksikheeliksi. Sekundaarstruktuure moodustab ka RNA. Rakkudes on DNA assotsieerunud erinevate valkudega, mille tulemusena DNA kaksikheeliks on volditud ja painutatud 3-mõõtmelisse struktuuri, mida nimetatakse DNA tertsiaarstruktuuriks. Tertsiaarstruktuure on kirjeldatud ka RNA puhul.

 

DNA denaturatsioon ja renaturatsioon

 

Kui vesilahuses olevat DNA-d kuumutada 100°C-ni, katkevad aluspaaridevahelised vesiniksidemed ja DNA ahelad eralduvad teineteisest. Sellist protsessi nimetatakse DNA denaturatsiooniks. Kui üksikahelaid sisaldava lahuse temperatuuri uuesti langetada, paarduvad komplementaarsed ahelad uuesti. Sel juhul on tegemist renaturatsiooniga. Kui denatureeritakse ja renatureeritakse DNA molekulide segu, kus DNA molekulide nukleotiidses järjestuses on erinevusi, võivad renaturatsiooni käigus liituda DNA ahelad, mis ei ole teineteise suhtes täielikult komplementaarsed, s.t. nad ei ole 100%-liselt homoloogilised. Sel juhul moodustub heterodupleks, kus on paardunud ainult komplementaarsed lämmastikalused ning seal, kus homoloogia puudub, jäävad DNA ahelad üksikahelalisteks. 

 

Kromosoomide struktuur

 

Viiruste genoom

 

Üldjuhul on viiruse pärilik informatsioon säilitatud ühe nukleiinhappe molekulina, milleks on kas DNA või RNA. Seega võib öelda, et viirustel on üks kromosoom. Viiruse genoomiks on kas üksik- või kaksikahelaline DNA või RNA molekul. Erinevate viiruste genoom varieerub mõnest tuhandest kuni mõnesaja tuhane nukleotiidini. Viiruste genoom on pakitud valkkattesse e. kapsiidi.

 

Bakterikromosoom

 

Nii nagu viirustel, on ka bakteritel kogu geneetiline informatsioon ühes kromosoomis. Bakterikromosoom on rõngasmolekul, mis esineb rakus kõrgelt struktureeritud kujul alas, mida nimetatakse nukleoidiks. Näiteks E. coli kromosoomi kontuurpikkuseks on 1100 mm, raku enda diameeter on aga ainult 1-2 mm, mistõttu kromosoom on ligi 1000 korda lühemaks kokku pakitud. DNA rõngasmolekul on kokku volditud, nii et moodustub 50-100 lingu. Genoomi voltimisel osalevad nii RNA kui ka valgud. Ühe DNA lingu moodustavad ligikaudu 40000 aluspaari. Selline DNA linge sisaldav struktuur suurendab kromosoomi kompaktsust aga ainult 10 korda. DNA kompaktsemaks muutmisel on oluline roll DNA superspiralisatsioonil.

 

DNA superspiralisatsioon toimub nii bakteri ka eukarüoodi rakus. DNA superspiralisatsioon tekib näiteks siis, kui üks DNA ahel on kaksikheeliksis teise, fikseertitud ahela suhtes roteerunud kas vasaku- või paremasuunaliselt. Kui keerdumine toimub kaksikheeliksi pöördumise suunas (seega paremasuunaliselt), viib see positiivse superspiralisatsiooni tekkele. Sel juhul on DNA ahelad teineteise suhtes tihedamalt kokku keerdunud. Vaba ahela vastassuunaline roteerumine viib negatiivse superspiralisatsiooni tekkele. Negatiivse superspiralisatsiooni puhul on DNA ahelad teineteisest rohkem lahti keerdunud ning võivad isegi eralduda. DNA negatiivsel superspiralisatsioonil on palju bioloogilisi funktsioone seoses DNA replikatsiooniga, rekombinatsiooniga, geenide avaldumise regulatsiooniga. DNA superspiralisatsioonil osalevad ensüümid, mida nimetatakse topoisomeraasideks. Topoisomeraasid viivad DNA kaksikheeliksisse kas üksik- või kaksikahelalisi katkeid ning lõdvendavad või pingutavad kaksikheeliksit. Seejärel viiakse katkenud DNA ahelate otsad omavahel jälle kokku. Bakterites on leitud topoisomeraas II, mida nimetatakse DNA güraasiks. See ensüüm tekitab DNA negatiivset superspiralisatsiooni ja vähendab positiivset superspiralisatsiooni. Topoisomeraas I on vastupidise toimega ja vähendab negatiivset superspiralisatsiooni. 

 

Negatiivne superspiralisatsioon on oluline bakterikromosoomi kompaktsemaks muutmisel. Keskmiselt on bakterikromosoomis iga kaksikheeliksi 40 täispöörde kohta üks negatiivne superspiraal.

 

Eukarüootsete kromosoomide struktuur

 

Kuigi võrreldes E. coli genoomiga on erinevatel eukarüootidel ainult 2-25 korda enam geene, ületab nende genoomi suurus bakteri genoomi mitu suurusjärku. Suur osa eukarüootsest DNA-st ei ole kodeeriv. Eukarüootidel on genoom jaotunud mitmeks erinevaks kromosoomiks ning enamasti on kõiki kromosoome 2 komplekti. Inimese genoomi moodustava DNA kogupikkus on ligikaudu 1 meeter. Erinevate kromosoomide DNA pikkus varieerub 15-85 millimeetrini. Et kogu selline DNA hulk rakku ära mahuks, peab see võrreldes bakteri DNA-ga olema märksa kompaktsemalt pakitud. Inimese kõige suurem kromosoom on metafaasis ainult 10 mm pikkune ja läbimõduga 0,5 mm.

 

Eukarüootse kromosoomi keemiline koostis.

 

Interfaasi rakkude tuumast isoleeritud kromatiin koosneb peamiselt DNA-st ja valkudest. Kromatiini koostises olevad valgud jaotuvad kahte suurde klassi:

 

1.         Histoonid – aluselised valgud (neutraalse pH juures positiivselt laetud), sisaldavad 20-30% arginiini ja lüsiini, mis on positiivse laenguga.

2.         Mittehistoonsed kromosoomivalgud – tugevalt happelised (neutraalse pH juures negatiivselt laetud).

 

Histoonidel on põhiline kromosoomi struktuuri kujundav roll. Kõrgemate eukarüootide kromatiin sisaldab ekvivalentses hulgas histoone ja DNA-d. Taimedel ja loomadel on 5 klassi histoone – H1, H2a, H2b, H3 ja H4. Need valgud on olemas peaaegu kõigis rakutüüpides v. a. spermarakkudes, kus nad on asendatud protamiinidega, mis on samuti aluselised valgud. Eritüüpi histoone on kromatiinis kindel hulk, mis on väljendatav molaarse suhtena 1 H1: 2 Ha: 2 H2b: 2 H3: 2H4. Histoonid on DNA-ga spetsiifiliselt komplekseerunud, moodustades kromatiinist struktuurseid alaüksusi, mida nimetatakse nukleosoomideks. Üks nukleosoom on  läbimõõduga 11 nm ning 6 nm kõrgune struktuur. Histoonid on fülogeneetiliselt väga tugevalt konserveerunud. 

 

Kromosoom koosneb ühest pikast DNA molekulist

 

Veenvaid tõendeid selle kohta, et kromosoomi moodustab algusest lõpuni üks DNA molekul (“unineemi mudel”), saadi lambiharjakromosoomide tsütoloogilistel uuringutel. Lambiharjakromosoomid on mikroskoopiliselt jälgitavad amfiibide oogeneesis, I profaasi vältel. Sel ajal on need kromosoomid kuni 800 mm pikkused. Homoloogilised kromosoomid on siis paardunud, olles eelnevalt duplitseerunud, mistõttu nad koosnevad kahest tütarkromatiidist. Lambiharjakromosoomidel on tsentraalne telg, kus tütarkromatiidid on tugevalt kondenseerunud ja lateraalsed lingud, mis kujutavad endast individuaalsete kromatiidide transkriptsiooniliselt aktiivseid piirkondi. DNaasi töötlus põhjustab nii telje kui ka lingude fragmenteerumist. Samas töötlus RNaasiga ja proteaasidega lambiharjakromosoome ei fragmenteeri.

 

Teatud erijuhtudel (näiteks polüteenkromosoomid äädikakärbse süljenäärmetes) on kromosoomid multineemse struktuuriga, mis tähendab seda, et palju identseid DNA kaksikahelaid on kromosoomis kõrvuti.

 

Seda, et kromosoom koosneb ühest DNA molekulist, on näidatud ka geelelektroforeesiga, kus uuritava liigi kromosoome on geelis lahutatud nende suuruse järgi ja leitud, et erineva pikkusega DNA molekule on sama palju kui on antud liigil erinevaid kromosoome.

 

 

Eukarüootse kromosoomi pakkimine

 

Metafaasi kromosoomi kondensatsiooniaste on võrreldes DNA molekuli kontuurpikkusega 10000 kordne. Võrreldes interfaasi kromosoomidega on meioosi ja mitoosi kromosoomid rohkem kondenseerunud. Eukarüoodi kromosoomi kondensatsioonil on eristatavad kolm astet.

 

1)       DNA nukleosoomne struktuur. Iga 200 nukleotiidi pikkuse DNA lõigu kohta on moodustunud üks nukleosoom, mis sisaldab 146 aluspaari. Nukleosoomid on ühendatud linkeraladega, mis on nukleaaside poolt atakeeritavad. Iga nukleosoomi koostises on 2 molekuli histoone H2a, H2b, H3 ja H4. DNA on nukleosoomis negatiivselt superspiraliseerunud ja keritud 1,75 korda ümber histoonidest moodustunud oktameeri. Histoon H1 on seondunud linkeralaga. Linkeralade pikkus võib varieeruda nii liigiti kui ka erinevates rakutüüpides liigisiseselt. Nende pikkus varieerub 8 aluspaarist 114-ni. Nukleosoomide struktuur geneetiliselt aktiivsetes kromosoomi piirkondades erineb struktuurist geneetiliselt inaktiivsetes piirkondades.

2)       Kromatiini kiud (ingl. k. fibers). Interfaasis on elektronmikroskoobi abil nähtavad 10 nm diameetriga nukleosoome sisaldavad kromatiini kiud. Meioosi- ja mitoosikromosoomide puhul on elektronmikroskoopiliselt tuvastatavad 30 nm diameetriga kiud, mis on tekkinud 10 nm kiudude baasil H1 osalusel. Vastavat struktuuri nimetatakse ka solenoidseks struktuuriks.

3)       Metafaasi kromosoom. Metafaasis saavutavad kromosoomid kõrgeima kondensatsiooni astme. Selle struktuuri moodustumisel, mis tekib 30 nm kiudude kokkupakkimisel, osalevad mittehistoonsed valgud. Moodustuvad radiaalsed lingud, mis on ankurdatud nukleaarsele skeletile. Iga ling sisaldab 50000-100000 aluspaari. Nukleaarne skelett koosneb erinevatest valkudest, mis on seonduvad üksteisega ja DNA-ga. DNA järjestused, mis seonduvad skeletile (scaffold-attached regions - SARs) on mõnisada nukleotiidi pikad ning A-T-rikkad. Iseloomulikud on motiivid, kus 3 või enam A-d või T-d on järjestikku. SAR-idel on oluline roll ka geeniekspressiooni regulatsioonil. 

 

Kõrgemat järku struktuurid kaitsevad kromosoome murdumast ja omavahel sassi minemast, kui tütarkromatiidid/kromosoomid anafaasis üksteisest lahknevad. Samal ajal takistab kromosoomide kõrge kondensatsiooniaste geenide transkriptsiooni, sest transkriptsioonil osalevad ensüümid ei pääse DNA-le ligi. Seetõttu transkribeeritakse M-faasis ainult väheseid geene.

 

Interfaasis (G1, S ja G2) on kromosoomide kondensatsiooniaste oluliselt vähenenud, kuigi ka sel ajal kinnituvad lingud nukleaarsele skeletile. Samal ajal on kromosoomid seotud ka tuuma sisemembraanile kinnitunud valkudega, mida nimetatakse lamiinideks. Interfaasi kromosoomide kompaktsusaste ei ole ühtlane. Vähemkondenseerunud alad, mida transkribeeritakse aktiivselt, vastavad eukromatiinile. Heterokromatiin on märksa kompaktsem ning transkriptsiooniliselt inaktiivne. Eristatakse konstitutiivset heterokromatiini, mida ei transkribeerita kunagi ning fakultatiivset heterokromatiini, mis formeerub teatud juhtudel eukromatiinist. Konstitutiivne heterokromatiin  sisaldab mittekodeerivaid kõrgelt korduvaid DNA järjestusi. Fakultatiivne heterokromatiin moodustub näiteks imetajatel teise X kromosoomi kondenseerumisel transkriptsiooniliselt inaktiivseks Barri kehakeseks. 

 

Tsentromeerid ja telomeerid

 

Tütarkromatiidide liikumisel anafaasis raku vastaspoolustele on nende tsentromeeridele kinnitunud mikrotuubulitest koosnevad kiud (kääviniidid). Metafaasi kromosoomis on tsentromeeri ala jälgitav kokkusurutud piirkonnana. Erinevate kromosoomide tsentromeeri regioonid - CEN regioonid on konserveerunud. Katsetes S. cerevisiae CEN regioonidega on näidatud, et ühe kromosoomi CEN regiooni asendamine teise kromosoomi CEN regiooniga ei mõjuta rakkude normaalset jagunemist. S. cerevisiae tsentromeer on 110-120 aluspaari pikkune ja sisaldab 3 olulist regiooni. Regioonid I ja III on lühikesed konserveerunud alad, mis piiritlevad regiooni II. Neile seonduvad spetsiifilised valgud, võimaldades kääviniitide kinnitumist tsentromeeridele. Regioon II on ~90 aluspaari pikkune, väga A-T-rikas järjestus (A:T sisaldus >90%).

 

Telomeeridel on 3 olulist funktsiooni:

1)       Takistavad DNA molekulide otste lagundamist nukleaaside poolt.

2)       Takistavad erinevate DNA molekulide otste kleepumist.

3)       Võimaldavad lineaarsete DNA molekulide otste replitseerumist, ilma et DNA molekulid kaotaksid replikatsiooni käigus otstest geneetilist materjali.

 

Telomeeridel on unikaalne struktuur, mis sisaldab tandeemsetes kordustes lühikesi nukleotiidseid järjestusi. Kuigi liigiti need järjestused mõnevõrra varieeruvad, on leitud konserveerunud motiivid  järjestusega 5'-T1-4A0-1G1-8-3'. Selgroogsetel on selleks järjestuseks TTAGGG, mille koopiaarv varieerub nii liigiti kui ka liigisiselt sõltuvalt kromosoomist ja ka rakutüübist. Inimese somaatilistes rakkudes sisaldavad telomeerid 500-3000 TTAGGG kordust. Organismi vananedes telomeerid lühenevad. Samal ajal ei toimu telomeeride lühenemist tüvirakkudes ega vähirakkudes.

 

DNA kordusjärjestused

 

Eukarüootne DNA jaotatakse vastavalt korduste olemasolule 3 klassi:

 

1.        Unikaalsed või ühe koopiana esinevad DNA järjestused - 1 kuni 10 koopiat genoomi kohta.

2.        Mõõdukalt korduvad DNA järjestused - 10 kuni 105 koopiat genoomi kohta.

3.        Kõrgelt korduvad DNA järjestused - enam kui 105 koopiat genoomi kohta.

 

Esimesse klassi kuulub enamus geene, mis on mõni tuhat kuni mõnikümmend tuhat nukleotiidi pikad.

 

Suur osa genoomist sisaldab mõõdukalt korduvaid DNA järjestusi ning ainult vähestel juhtudel (geenid, mis kodeerivad histoone, ribosomaalset RNA-d ja ribosoomivalke, mida vajatakse rakus palju) on tegemist sama geeni kordustega. Enamasti on mõõdukalt korduvate DNA järjestuste rolliks geeniregulatsioon. Kuna eukarüootse DNA replikatsioon algab paljudelt spetsiifilistelt järjestustelt, mida nimetatakse ori-järjestusteks (origin of replication), paigutuvad ka need mõõdukalt korduvate DNA järjestuste klassi. Siia klassi kuuluvad ka transponeeruvad geneetilised elemendid, mis on olulised geneetilise materjali evolutsioneerumise seisukohalt, kuna nende liikumisega genoomi ühest piirkonnast teise kaasnevad mutatsioonid ja geneetilised ümberkorraldused. Inimesel on kirjeldatud näiteks LINE (Long Interspersed Nuclear Element) ja SINE (Short Interspersed Nuclear Element) perekonda kuuluvad transponeeruvad elemendid. LINE perekonnast on enamtuntud L1 element (6500 aluspaari pikk), mida on genoomi kohta 20000-50000 koopiat, seega ligi 5% kogu inimese DNA-st. SINE elemendid on 150 kuni 300 aluspaari pikad. Kõige detailsemalt on uuritud Alu elementi, mida on 500 000 koopiat genoomi kohta. Nimetus Alu tuleneb sellest, et seda järjestust tunneb ära ja "lõikab" spetsiifiliselt endonuleaas nimetusega AluI.

 

Kõrgelt korduvad järjestused asuvad enamasti geneetiliselt inaktiivses heterokromatiini piirkonnas, näiteks tsentromeeri lähedal. Kõrgelt korduvatele DNA järjestustele omistatakse mitmeid funktsioone:

1)       Struktuurne või organisatoorne roll kromosoomides;

2)       Osalemine kromosoomide paardumisel meioosis;

3)       Osalemine ristsiirdes (krossingover) või rekombinatsioonis;

4)       Tähtsate struktuurgeenide (histoonide, rRNA, ribosoomivalkude geenide kaitsmine);

5)       Alusmaterjal evolutsiooniks;

6)       Lihtsalt "rämps-DNA", mis on aja jooksul kuhjunud.

 

Kordusjärjestuste isoleerimine ja identifitseerimine ja lokaliseerimine

 

Kõige täpsemat informatsiooni kordusjärjestuste arvu ja iseloomu kohta saadakse genoomi nukleotiidse järjestuse määramisel e. sekveneerimisel. Selleks aga, et lokaliseerida kordusjärjestusi kromosoomis, kasutatakse kromosoomide in situ (kohapeal) hübridiseerimist eelnevalt isoleeritud ja märgistatud kordusjärjestusega. Metafaasikromosoomid kantakse klaasplaadile, viiakse läbi DNA denaturatsioon, nii et DNA muutub üksikahelaliseks ja renatureeritakse üksikahelalise, näiteks fluorestseeruva värviga märgistatud kordusjärjestusega. Fluorestsentsvärvidega märgitud hübridisatsiooniproovide kasutamise puhul nimetatakse protseduuri FISH-iks (Fluorescent In Situ Hybridization). Renaturatsiooni käigus paarduvad DNA ahelad komplementaarsusprintsiibil ning märgistatud üksikahelaline DNA hübridiseerub talle homoloogiliste piirkondadega kromosoomis. FISH-i abil on demonstreeritud näiteks kordusjärjestuse TTAGGG paiknemine telomeerides.

 

DNA tsentrifuugimisel CsCl gradiendis on võetud kasutusele mõiste "satelliit-DNA". Satelliit-DNA puhul on tegemist kordusjärjestustega, mille A:T ja G:C paaride suhe erineb oluliselt ülejäänud genoomi A:T ja G:C paaride suhtest. Sellised DNA-d sukelduvad võrreldes ülejäänud genoomse DNA fragmentidega CsCl gradienti erinevalt (A:T paaride-rikas DNA on väiksema tihedusega kui G:C paaride-rikas DNA) ning seetõttu on tsentrifuugitopsis lisaks põhilisele DNA fraktsioonile eristatavad veel diskreetsed minoorsed fraktsioonid. Neis sisalduvat DNA nimetatakse satelliit-DNA-ks. Näiteks hiirel on isoleeritud satelliit-DNA, mis hiljem in situ hübridisatsiooni abil lokaliseeriti heterokromatiini regiooni tsentromeeride kõrvale. Hiire genoomis on seda ligi 400 aluspaari pikkust kordusjärjestust 106 koopiat, mis moodustab ~10% genoomist. Ka teiste liikide satelliit-DNA-de puhul on leitud, et need lokaliseeruvad valdavalt tsentromeeri läheduses heterokromatiinis või siis telomeerides.

 

<tagasi

11. DNA replikatsioon

 

Replikatsioonist üldiselt

 

Nukleiinhappe (DNA või RNA) ahel kasvab 5’®3’ suunas. Fosfodiesterside moodustub kasvava nukleiinhappe ahelas oleva viimase nukleotiidi suhkrujäägi 3’-OH rühma ja lisanduva nukleotiidi suhkrujäägi 5’ C-ga seotud fosfaadi vahel. Nukleiinhappe sünteesil lülituvad sünteesitavasse ahelasse nukleotiidid, mis on komplementaarsed matriitsahela nukleotiididega. Sünteesi viivad läbi polümeraasid.

 

Matriitsina toimib üksikahelaline nukleiinhape. Seega peab kaksikahelaline DNA replikatsiooni initsiatsioonisaidist olema eelnevalt viidud üksikahelaliseks. DNA ahelate eraldumist teineteisest katalüüsib DNA helikaas.

 

Nukleiinhapete sünteesi läbiviivad polümeraasid:

 

1.        DNA polümeraas – ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Toimub DNA replikatsioon. Vajab sünteesil praimerit, mis on paardunud matriitsahelaga. Praimeriks on lühike oligonukleotiid (DNA või RNA ahel)

 

2.        RNA polümeraas – ensüüm, mis sünteesib DNA ahelale komplementaarse RNA ahela. Toimub transkriptsioon. Transkriptsiooni initsiatsiooniks seondub RNA polümeraas spetsiifiliselt promootorjärjestusega ning seejärel katkevad promootrorpiirkonnas DNA ahelate vahelised vesiniksidemed. Ei vaja initsiatsiooniks praimerit.

 

3.        Pöördtranskriptaas e. revertaas – ensüüm, mis sünteesib RNA ahelale komplementaarse DNA ahela. Vajab sünteesil paimerit.

 

Nukleaasid

 

Ensüümid, mis degradeerivad nukleiinhapet, lõhkudes fosfodiestersidemeid.

 

1.        Eksonukleaasid – lagundavad nukleiinhappe ahelat kas 5’ või 3’ otsast.

5’eksonukleaasid

3’eksonukleaasid

 

2.        Endonukleaasid – lagundavad nukleiinhapet, lõhkudes fosfodiestersidemeid ahelasiseselt

Restriktsioonilised endonukleaasid e. restriktaasid

 

DNA ligaas – ensüüm, mis liidab DNA ahelate otsad, katalüüsides fosfodiestersideme moodustumist 5’ fosfaadi ja 3’-OH rühma vahel.

 

DNA replikatsiooni käigus lülitatakse kasvavasse DNA ahelasse inimesel 3000 nukleotiidi minutis, bakteril 30000 nukleotiidi minutis. DNA sünteesil eristatakse 3 etappi - initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon. Replikatsioonil käituvad matriitsina mõlemad DNA ahelad ning replikatsiooni lõpp-produktideks on kaksikheeliksid, milles üks ahel on uus ja teine vana. Seega toimub DNA replikatsioon semikonservatiivse mudeli alusel. DNA replikatsiooni puhul on käsitletud aga ka teisi mudeleid. !950-ndatel aastatel konkureerisid omavahel 3 mudelit.

 

DNA replikatsiooni mudelid

 

1)       Konservatiivne mudel - algselt kaksikheeliksilt sünteesitakse uus kaksikheeliks. Tulemuseks on 2 DNA molekuli, millest ühes on koos vanad ahelad ja teises uued.

2)       Semikonservatiivne mudel - mudel, mis leidis hiljem ka tõestust.

3)       Dispersiivne mudel - mõlemad tütarahelad sisaldavad segu vanadest ja uuesti sünteesitud lõikudest.

 

Semikonservatiivse mudeli tõestamine

 

1958. a. näitasid Matthew Meselson ja Franklin Stahl, et E. coli rakkudes toimub DNA replikatsioon semikonservatiivse mudeli alusel. Lämmastikul on olemas kerge (14N) ja raske (15N) isotoop. Normaalne on kerge isotoop. DNA-sse saab lülitada rasket isotoopi sel viisil, et kasvatatakse baktereid söötmel, milles on 14N asemel 15N. Saadakse n.ö. rasked DNA ahelad. DNA lahuse tsentrifuugimisel CsCl tihedusgradiendis liiguvad DNA molekulid gradiendi sellesse osasse, mis vastab nende tihedusele. Kui mõlemad DNA ahelad on kerged, jäävad DNA molekulid CsCl gradiendis tsentrifuugitopsis kõrgemale, kus CsCl lahus on väiksema tihedusega. Kui mõlemad ahelad on rasked, on DNA kontsentreerunud allapoole, suurema tihedusega alasse. Kui üks ahel on kerge ja teine raske, kontsentreerub DNA tsentrifuugimisel eelmiste variantidega võrreldes vahepealsesse alasse. Meselson ja Stahl kasvatasid baktereid mitmete põlvkondade vältel 15N isotoopi sisaldaval söötmel, mille tulemusena olid kõik DNA ahelad rasked. Seejärel viidi rakud jälle kerge isotoobiga söötmesse ja tsentrifuugiti DNA-d, mis oli eraldatud 1, 2 ja 3 põlvkonda kasvanud rakkudest. Esimese põlvkonna rakkude DNA kontsentreerus CsCl tihedusgradiendis ainult ühte, vahepealse tihedusega fraktsiooni. Seega olid kõik DNA molekulid hübriidsed, sisaldades kerget ja rasket ahelat. Teise põlvkonna rakkudest isoleeritud DNA puhul saadi kerge ja vahepealne fraktsioon suhtes 1:1. Kolmanda põlvkonna rakkudest eraldatud DNA puhul oli kerget fraktsiooni 3/4 ja vahepealset ¼. Nii konservatiivse kui ka dispersiivse mudeli puhul oleksid tulemused olnud teistsugused.

 

Eukarüootse DNA replikatsiooni toimumist semikonservatiivse mudeli alusel näitasid J. Herbert Taylor, Philip Wood ja Walter Hughes oa juurte otste rakkudest eraldatud kromosoomide analüüsil. Rakke kasvatati 3H-tümidiini söötmel, et märgistada DNA radioaktiivselt. Seejärel töödeldi rakke kolhitsiiniga, mis takistab funktsionaalse mitoosikäävi moodustumist. Selle tagajärjel ei toimu mitoosi anafaasis tütarkromatiidide lahknemist. Nii sai visuaalselt jälgida, kuidas radioaktiivsus märgistamisele järgnenud rakkude kasvatamisel mitteradioaktiivsel söötmel põlvkondade jooksul tütarkromatiididesse jaotus. Esimese põlvkonna rakkude puhul oli kõigil kromatiididel radioaktiivne signaal. Teise põlvkonna rakkudes oli ainult üks kromatiididest tütarkromatiidide paaris radioaktiivne.

 

DNA replikatsiooni visualiseerimine autoradiograafia abil

 

1963. a. kirjeldas John Cairns replitseeruva bakterikromosoomi struktuuri. Ta kasvatas baktereid radioaktiivset tümidiini sisaldaval söötmel, eraldas rakkudest võimalikult terved DNA molekulid ning kandis need membraanfiltritele. Membraanfiltritelt tehtud autoradiograafiatel oli näha, et E. coli kromosoom on tsirkulaarne. Replitseeruva DNA puhul ilmnes q-struktuur. DNA replikatsioonil eraldusid DNA ahelad teineteisest spetsiifilises kohas ning mõlemale ahelale sünteesiti komplementaarne ahel. Ka see katse kinnitas DNA replikatsiooni toimumist semikonservatiivse mudeli alusel. Algul arvati, et kromosoomi replikatsioon toimub replikatsiooni alguspunktist ainult ühes suunas.

 

Hiljem leidis kinnitust kahesuunaline replikatsiooni mudel, mille alusel liiguvad Y-kujulised replikatsioonikahvlid mööda tsirkulaarset kromosoomi vastassuundades. Kahesuunalise replikatsiooni tõestamiseks kasutati meetodit, mis põhines DNA denatureerunud alade kaardistamisel. Katsed viidi läbi bakteriofaag lambda replitseeruva DNA-ga. Kui DNA molekule kuumutada 100°C juures või viia keskkonna pH aluseliseks (pH 11,4), katkevad komplementaarsete DNA ahelate vahel vesiniksidemed. Kuna A:T-paaridel on võrreldes G:C-paaridega üks vesinikside vähem, denatureeruvad A:T-rikkad piirkonnad kiiremini ja neid regioone on võimalik elektronmikroskoobis näha. Faag lambda kromosoomis on A:T-rikkaid järjestusi ainult teatud kohtades ning seetõttu saab neid kohti kasutada füüsiliste markeritena. Schnös ja Inman uurisid elektronmikroskoopia abil faag lambda DNA hargnemiskohtade (Y-kujuliste replikatsioonikahvlite) liikumist denatureerunud piirkondade suhtes ja nägid, et replikatsioonikahvlid eemaldusid teineteisest. 

 

DNA replikatsiooni alguspunkt

 

DNA replikatsiooni initsiatsioon on limiteeritud spetsiifiliste initsiatsiooni regioonide - ori regioonide olemasoluga. Nimetus ori tuleneb inglisekeelsest terminist “origin of replication”. Replikatsiooni initsiatsiooniks on vajalik DNA ahelate lokaalne lahtikeerdumine ning praimeri süntees. Praimerit on vaja selleks, et sünteesitaval polünukleotiidahelal oleks vaba 3'-OH ots, kuhu DNA polümeraas saab liita nukleotiide (vt. fosfodiestersidemete moodustumine DNA ahelas!). Erinevate DNA molekulide replikatsiooni puhul võib praimeriks olla kas DNA või RNA, samuti valguga seondunud nukleotiid. Praimeri sünteesib kas RNA polümeraas või primaas (ingl. k. primase). DNA dupleksi avamine võib toimuda kas transkriptsiooni toimel (faagid T4, T7, mõned ColE1 replikoni sisaldavad plasmiidid E. coli´s) või spetsiifiliste initsiaatorvalkude seondumise tulemusena (DnaA oriC puhul, O oril puhul). Kuna DNA dupleksi avamine on lihtsam A-T rikastest regioonidest, on ori regioonid alati A-T rikkad. Bakterikromosoomi replikatsioon toimub rakutsükli teatud etapil.

 

DNA replikatsiooni alguspunkt bakteritel

 

oriC on 245 aluspaari pikkune ning eubakterites tugevalt konserveerunud. Funktsionaalne oriC sisaldab kindlaid DNA järjestusi, mis esinevad kordustes:

 

1) DnaA boksid initsiaatorvalgu DnaA seondumiseks (4 koopiat)

 

                5’-TTAT(C/A)CA(C/A)A-3’

  

2) 11 koopiat Dam metülaasi poolt äratuntavat järjestust 5’-GATC-3’, nendest 8 asukoht on tugevalt konserveerunud. DNA metülatsiooni kaudu reguleeritakse replikatsiooni initsiatsiooni toimumist rakus.

 

3) DnaA boksidest vasakule jääb 3 A:T-rikast 13 nukleotiidi pikkust järjestust, mis on määrava tähtsusega DNA ahelate lokaalsel lahtisulamisel. DNA ahelate lahtisulamise tulemusena ilmneb struktuur, mida nimetatakse replikatsiooni mulliks.

 

Lisaks seonduvad oriC-le mitmed DNA-d painutavad valgud (HU, IHF).

 

DNA replikatsiooni alguspunktid eukarüootidel

 

Erinevalt bakterikromosoomist on eukarüoodi kromosoomidel palju replikatsiooni alguspunkte. Need on jaotunud üle kromosoomi, paiknedes keskeltläbi iga 100 000 aluspaari tagant. Pärmil S. cerevisiae on isoleeritud ARS elemendid (Autonomously Replicating Sequences), mille olemasolu korral on tsirkulaarne DNA pärmis võimeline autonoomselt replitseeruma. ARS elemendid on ~50 aluspaari pikkused A:T-rikkad järjestused.

 

DNA polümeraasid

 

Bakteril E. coli on leitud 5 DNA polümeraasi – DNA polümeraasid I, II ja III ning hiljem polümeraasid IV ja V. Polümeraasid I ja II osalevad DNA vigade parandusel (reparatsioonil), DNA polümeraas III on põhiline DNA replikatsiooni ensüüm. DNA polümeraasid IV (DinB) ja V (UmuD´2C) on seotud vigaderohke DNA sünteesiga olukorras, kus DNA polümeraasi III poolt läbiviidav replikatsioon on blokeerunud DNA kahjustuste tõttu. Nendel ensüümidel puudub vigu korrigeeruv (proof reading) aktiivsus.

 

Eukarüootsetes rakkudes on samuti mitmeid DNA polümeraase. Imetaja rakkudes on tuntumad 5 erinevat polümeraasi: a, b, d, e, ja g. a ja d töötavad koos ning on seotud tuuma DNA replikatsiooniga ning g mitokondriaalse DNA replikatsiooniga. b ja e osalevad tuuma DNA reparatsioonil.

 

E. coli DNA polümeraas I

   

Esimene DNA in vitro süntees viidi läbi 1957. a. Arthur Kornbergi laboris, kasutades E. coli DNA polümeraasi I. DNA polümeraasi I (Pol I) on seetõttu nimetatud ka Kornbergi ensüümiks. DNA replikatsioon toimus keskkonnas, kuhu olid lisatud desoksüribonukleosiid trifosfaadid, Mg2+ ioonid, paljundatav DNA ja vaba 3'-OH otsaga oligonukleotiid - praimer, mis oli komplementaarne piirkonnaga matriitsina kasutavast DNA ahelast. DNA polümeraas I katalüüsis fosfodiestersideme moodustumise praimeri 3'-OH rühma ja DNA ahelasse lülitatava nukleotiidi 5'-fosfaadi vahel. Nukleotiidide lülitumist DNA ahelasse testiti sel viisil, et kasutati 32P-ga märgistatud nukleotiide ja pärast reaktsioonisegu inkubeerimist 30 minutit 37°C juures sadestati nukleiinhape happelises keskkonnas, (mis saavutati perkloorhappe lisamisega) ning mõõdeti radioaktiivsust DNA sademes ja supernatandis. Radioaktiivne märge oli nii supernatandis kui ka DNA sademes. Kuna nukleotiidid antud tingimustes sadeneda ei saanud, näitasid katsetulemused radioaktiivselt märgistatud nukleotiidide lülitumist DNA ahelasse, seega DNA sünteesi toimumist.

 

Lisaks 5' ®  3'  polümeraassele aktiivsusele on Pol I-el ka 5' ® 3' ja 3´® 5' eksonukleaasne aktiivsus. DNA polümeraas I deletsioonvarianti, millel puudub  5' ®  3'  eksonukleaasne aktiivsus, nimetatakse Klenowi fragmendiks. 

 

E. coli DNA polümeraas III

 

DNA polümeraas III on põhiline bakteri DNA replikatsioonil osalev ensüüm Ta koosneb mitmetest subühikutest. Multiensüümkompleks on V-kujuline, sisaldab 2 apoensüümi. Ülejäänud subühikutes on erinevusi. Apoensüümi moodustavad subühikud a, e ja q. Kuna DNA replikatsioon saab toimuda ainult ühes suunas, 5' ® 3' suunaliselt, replikatsioonikahvlis toimub süntees aga mõlemalt ahelalt korraga, on teine ahel replikatsioonikompleksis linguna kaasas ning sealt toimub süntees Okazaki fragmentidena. Polümeraasi õlad sünteesivad erinevaid ahelaid - vasak õlg pidevalt sünteesitavat  juhtivat ahelat (leading strand) ning parem õlg Okazaki fragmentidena sünteesitavat mahajäävat ahelat (lagging strand).

 

Selleks, et DNA replikatsiooni läbiviiv ensüümkompleks koos püsiks, on Okazaki fragmentidena sünteesitav DNA ahel linguna replikatsioonikahvlis. g-kompleks võimaldab ensüümikompleksi liikumist valmissünteesitud Okazaki fragmendi otsast järgmise praimeri 3’ OH otsa.  Mutatsioonisagedus Okazaki fragmentidena sünteesitavas DNA ahelas on ligikaudu 20 korda suurem kui pidevalt sünteesitavas ahelas – ensüümkompleks liigub kahjustustest kõrgema sagedusega üle.

 

DNA polümeraas III subühik e (epsilon) vastutab DNA replikatsiooni täpsuse eest, tal on 3’ ® 5’ eksonukleaasne aktiivsus, mis võimaldab valesti DNA ahelasse lülitatud nukleotiide kõrvaldada (lisab DNA polümeraasile “proofreading” aktiivsuse). b-dimeerid (b-klamber, ingl. k. b clamp) suurendavad polümeraasi protsessiivsust 20 nt/sek kuni 750 nt/sek.

 

DNA polümeraaside "proofreading" e. korrigeeriv aktiivsus.

 

DNA sünteesil tekib vigu sagedusega on 10-4 kuni 10-6 lülitatava nukleotiidi kohta. Selleks, et geneetilise materjali reprodutseerimise käigus ei toimuks vigade kuhjumist, on DNA polümeraasil korrigeeriv aktiivsus, mille tulemusena ensüümi töö täpsus tõuseb mitu suurusjärku (vigade teke sagedusega 10-8). Nagu juba eelpool mainitud, vastutab DNA polümeraasi III korrigeeriva aktiivsuse eest subühik e (epsilon). Eukarüootsete DNA polümeraaside puhul on korrigeeriv aktiivsus leitud 3-l polümeraasil (d, e, ja g). a ja d puhul on selleks vaja abistavaid valke.

 

DNA replikatsioon toimub mõlemalt DNA ahelalt korraga.

 

DNA süntees toimub ainult 5'® 3' suunaliselt. Samas pikendatakse replikatsioonikahvlis mõlemat DNA ahelt. 5'® 3' suunas kasvava DNA ahela puhul toimub pidev DNA süntees. Seda DNA ahelat nimetatakse juhtivaks ahelaks (leading strand). Teise ahela puhul, mis pikeneb 3’ ® 5’ suunas, toimub tegelikult samuti 5'® 3' suunaline süntees, kuid katkendlikult, lühikeste fragmentidena, mida nimetatakse Okazaki fragmentideks. Seda DNA ahelat nimetatakse mahajäävaks ahelaks (lagging strand).

 

DNA sünteesi alustamiseks on vaja vaba 3'-OH otsaga praimerit. Juhtiva ahela süntees vajab praimerit ainult replikatsiooni alguspunktis. E. coli puhul sünteesib praimeri DNA primaas (primase) DnaG. Sünteesitav RNA praimer on tavaliselt 10-60 nukleotiidi pikk. Eukarüootide puhul on praimerid lühemad, ligikaudu 10 nukleotiidi pikkused. Okazaki fragmentide puhul on iga fragmendi sünteesiks vaja uut praimerit. Okazaki fragmentide sünteesi initsiatsiooniks on vaja valkkompleksi, mida nimetatakse praimosoomiks. Praimosoom koosneb DNA helikaasist ja primaasist. Praimosoom liigub mööda DNA molekuli, kasutades ATP energiat. DNA helikaas keerab lahti DNA kaksikahela ja DNA primaas sünteesib praimeri. RNA praimeritelt jätkab sünteesi DNA polümeraas III. DNA topoisomeraasid teevad DNA ahelatesse ajutisi katkeid, et soodustada DNA ahelate lahtikeeramist. Üksikahelalist DNA-d stabiliseerivad sellele seonduvad SSB (single strand binding protein) valgud. RNA praimerid asendatakse hiljem DNA-ga DNA polümeraas I poolt ning DNA ahelad ühendatakse fosfodiestersidemete kaudu DNA ligaasi poolt. DNA polümeraas I lagundab RNA praimeri 5'® 3' eksonukleaasse aktiivsusega ja sünteesib asemele DNA ahela 5'® 3' polümeraasse aktiivsusega.

 

DNA süntees Okazaki fragmentidena avastati 1960-ndatel aastatel Reiji ja Tuneko Okazaki poolt. Nad pulss-märkisid kasvavaid E. coli rakke väga lühikese aja vältel (15 sekundit) radioaktiivse 3H-tümidiiniga (pulse-labeling experiments). Seejärel eraldasid nad märgitud DNA, denatureerisid selle ja lahutasid tsenrtrifuugimisega sahharoosi gradiendis. Enamus märget oli lülitunud lühikestesse, 1000 kuni 2000 nukleotiidi pikkustesse DNA fragmentidesse. Kui teha pulss-märkimist pikema aja jooksul, on märge liikunud fraktsiooni, kus on pikad, E. coli kromosoomile vastavad DNA molekulid. Radioaktiivne tümidiin lülitatakse kromosoomi-suurustesse DNA molekulidesse ka siis, kui esmalt märgitakse rakke lühiajaliselt 3H-tümidiiniga ning seejärel kasvatatakse pikemat aega mitteradioaktiivsel söötmel (pulse-chase experiments). Need katsed kinnitavad, et Okazaki fragmendid on DNA replikatsiooni vaheproduktiks.

 

Juhtiva ja mahajääva DNA ahela süntees on väga täpselt koordineeritud protsess. Kogu replikatsiooniaparaati, mis liigub mööda DNA molekuli replikatsioonikahvlina, nimetatakse replisoomiks. Replisoom koosneb DNA polümeraas III holoensüümist, mille üks apoensüüm sünteesib juhtivat ahelat ja teine mahajäävat ahelat ning praimosoomist.   

 

DNA replikatsiooni initsiatsioon oriC-lt bakteris E. coli

 

Algne initsiatsioonikompleks moodustub 20-30 DnaA monomeeri sidumisel. ATP juuresolekul toimub avatud kompleksi moodustumine, kusjuures DNA ahelate lahtikeerdumine algab kõige parempoolsemast 13-meerist. Seejärel moodustavad DnaB helikaas ja DnaC denatureerunud DNA-ga prepraimingkompleksi. SSB (üksikahelalise DNA-ga seonduv valk) ja güraasi (topoisomeraas II) juuresolekul jätkub DNA ahelate lahtikeerdumine mõlemas suunas. Järgneb praimeri süntees primaasi DnaG poolt, DNA polümeraas III moodustab replikatsioonikahvli ning edasi toimub oriC-st lähtuv tütarmolekulide süntees mõlemas suunas.

 

DNA ahelate lahtikeeramisel osalevad valgud

 

1.        DNA helikaas keerab DNA ahelaid lahti, kasutades ATP energiat. Bakteris E. coli toimub DNA replikatsioon kiirusega 30000 nukleotiidi minutis. Seega peavad DNA ahelad lahti keerduma kiirusega 3000 pööret minutis. E. coli põhiline DNA helikaas on DnaB.

2.        Üksikahelalise DNA-ga seonduvad SSB valgud (single-strand DNA-binding proteins) ei lase üksikahelalisel DNA-l moodustada juuksenõelastruktuure. Viimased takistaksid DNA replikatsiooni toimumist. SSB seondumine on kooperatiivne - ühe monomeeri seondumine stimuleerib järgmiste monomeeride seondumist. Seetõttu kaetakse kogu üksikahelaline DNA kiiresti SSB molekulidega.

3.        DNA topoisomeraasid katalüüsivad DNA ahelatesse ajutisi katkeid, kuid jäävad ise lõigatud molekulide otstega kovalentselt seotuks.

1)       Topoisomeraas I tüüpi ensüümid viivad DNA molekuli üksikahelalise katke ja kõrvaldavad ühe superspiraali. Nad konserveerivad energia, mis vabaneb fosfodiestersideme lõikamisest ning kasutavad seda hiljem sideme taastamiseks. Sellesse klassi kuuluvad ensüümid võivad kõrvaldada nii positiivseid kui ka negatiivseid supersiraale. E. coli topoisomeraas I (geeni topA produkt) kõrvaldab ühe katkega ühe negatiivse superspiraali.

2)       Topoisomeraas II tüüpi ensüümid viivad DNA molekuli ajutiselt kaksikahelalise katke ja lisavad või kõrvaldavad ühe ataki käigus ATP energiat kasutades 2 superspiraali. Nad jäävad DNA otstega kovalentselt seotuks ning hiljem taastavad fosfodiestersidemed.  Kõige paremini on uuritud E. coli ensüümi DNA güraas, mis on tetrameerne valk (koosneb kahest subühikust GyrA ja GyrB). DNA güraasi on vaja E. coli DNA replikatsioonil. Kromosomaalne DNA on negatiivselt superspiraliseeritud. Negatiivseid superspiraale toob DNA molekuli DNA güraas. Negatiivne superspiralisatsioon soodustab liikuva replikatsioonikahvli ees olles DNA ahelate lahtikeerdumist. Kui güraas on inhibeeritud näiteks nalidiksiinhappe või koumermütsiini poolt, bakterites DNA replikatsiooni ei toimu.

 

 

Veereva ratta replikatsioonimudel

 

Veereva ratta mudeli alusel toimub paljude viiruste genoomi replikatsioon, geneetilise informatsiooni ülekanne rakust rakku bakterite konjugatsioonil ning ribosomaalse RNA ekstrakromosomaalne amplifikatsioon amfiibide oogeneesis. Nagu juba nimi vihjab, replitseeruvad selle mudeli alusel tsirkulaarsed DNA molekulid. Üks algse DNA ahelatest jääb rõngaks ja on matriitsiks sünteesitavale komplementaarsele DNA ahelale. Replikatsioon algab, kui järjestuse-spetsiifiline nukleaas tekitab replikatsiooni alguspunktis ühte DNA ahelasse katke. DNA ahela pikenemine algab vabast 3'-OH otsast ning 5'-fosfaadiga lõppev ahela ots eemaldub rõngast DNA sünteesi käigus. See ots nagu "veereks" rõngalt maha. Sünteesiproduktideks võivad olla pikad üksik-või kaksikahelalised DNA molekulid, milles võib lineaarsetes kordustes sisalduda mitu koopiat algsest DNA järjestusest. Kui sünteesitakse kaksikahelaline DNA, toimub teise ahela süntees Okazaki fragmentidena. Üksikahela paljundamisel lõigatakse replitseerunud DNA ahel saitspetsiifiliselt replikatsiooni alguspunkti kohal katki ning viiakse rõngasmolekuliks. Ensüümid, mis osalevad DNA replikatsioonil veereva ratta mudeli alusel, on oma põhiolemuselt samad nagu eelpoolkirjeldatud DNA replikatsioonil, kus olid jälgitavad q-struktuurid.

 

Eukarüootse kromosoomi replikatsioon

 

Enamus informatsiooni DNA replikatsiooni kohta on saadud E. coli ja tema viiruste replikatsiooni uuringutest. Eukarüootse DNA replikatsiooni kohta on vähem teavet, kuid ka selle põhjal võib öelda, et nii eukarüoodi kui ka prokarüoodi DNA replikatsiooni põhimehhanismid on samad. Mõlemal juhul toimub replikatsioon semikonservatiivse mudeli alusel, ühelt DNA ahelalt pidevalt, teiselt Okazaki fragmentidena. Siiski on eukarüoodi DNA replikatsioonil ka unikaalseid aspekte.

 

1)       Eukarüootses rakus toimub DNA süntees ainult rakutsükli ühel etapil, mitte pidevalt nagu see sageli on prokarüootse raku korral, kus bakterid poolduvad kiiremini kui kulub aega kogu kromosoomi replikatsiooniks. Kuna eukarüoodi kromosoomid on võrreldes prokarüoodi kromosoomidega oluliselt suuremad, on neil palju replikatsiooni alguspunkte. Vastasel juhul, kui replikatsioon algaks ainult ühest kohast, kuluks kogu kromosoomi replikatsiooniks liiga palju aega. Näiteks äädikakärbse kõige suurema kromosoomi replikatsiooniks 3,5 minuti jooksul on vaja, et tööd alustaksid korraga 7000 replikatsioonikahvlit. Kiire DNA süntees on vajalik siis, kui rakutuumad poolduvad embrüo varajases arengus iga 9-10 minuti tagant. DNA segmenti, mille replikatsiooni kontrollitakse ühe replikatsiooni alguspunkti ja 2 termineeriva järjestuse poolt, nimetatakse replikoniks. Eukarüoodi kromosoomil on palju replikone. Prokarüoodil võib replikoniks olla terve kromosoom.

 

2)       Eukarüootidel on juhtiva ja mahajääva DNA ahela sünteesiks 2 erinevat DNA polümeraasi, d juhtiva ahela sünteesiks, a, millel on ka primaasi aktiivsus, viib läbi mahajääva ahela sünteesi. Lisaks osaleb protsessis terve rida abistavaid valke. Näiteks PCNA (proliferating cell nuclear antigen) on polümeraasi d kofaktoriks, mis kiirendab replikatsiooni.

 

3)       Eukarüootne DNA on koos histoonidega nukleosoomideks organiseeritud. Replikatsiooni ajal nukleosoomi struktuur muutub. Replikatsioonikahvli läbiminekul jaotub nukleosoom ajutiselt kaheks alaosaks. Koos DNA replikatsiooniga S faasis tõuseb hüppeliselt ka histoonide süntees. Seda selleks, et pakkida sünteesitud DNA nukleosoomideks.

 

4)       Kromosoomid on lineaarsed DNA molekulid. Selleks, et replikatsiooni käigus geneetilist materjali kromosoomide otstest kaotsi ei läheks, on välja kujunenud spetsiifiline mehhanism, mis põhineb telomeeride struktuuri omapäral. Telomeeride pikendamisel osaleb RNA-d sisaldav ensüüm telomeraas. Inimese telomeerid sisaldavad tandeemselt korduvat järjestust TTAGGG. Telomeraas tunneb ära G-rikka järjestuse telomeeri 3’ üksikahelalisest otsast ja pikendab seda 5’® 3’ suunas, kasutades matriitsina kaasas olevat RNA-d. Kui telomeraas on telomeeri otsa piisavalt pikendanud, olles sünteesinud sinna kordusjärjestusi, sünteesib DNA polümeraas pikendatud ahelale komplementaarse ahela.

 

 

Telomeeride pikkus ja vananemine

 

Erinevalt idurakkudest inimese somaatilistes rakkudes telomeraasi aktiivsus enamasti puudub. Kui inimese rakke kasvatada kultuuris, poolduvad nad teatud arvu põlvkondi (tavaliselt 20 – 70 rakujagunemist) ja siis surevad. Rakkude vananedes telomeerid lühenevad. Rakud, kus telomeerid on pikemad, jagunevad rohkem arv kordi kui need, kus telomeerid on lühemad. Kuna somaatilistes rakkudes telomeraas ei avaldu, ongi see põhjuseks, miks telomeerid iga replikatsioonitsükli järel lühenevad. Telomeraas on aktiveerunud vähirakkudes, kus rakujagunemine on väljunud kontrolli alt. Vähirakud on koekultuuris võimelised lõpmatult paljunema, teisisõnu on nad saavutanud surematuse.

 

Inimestel on kirjeldatud pärilik haigus progeeria, kus indiviidid vananevad enneaegselt. Eriti raske haigusvormi puhul (Hutchinson-Gilfordi sündroom) hakkavad vananemise sümptomid (kortsude teke, kiilaspealisus) ilmnema juba sünnijärgselt ja sellised lapsed surevad teismeliselt. Leebema haigusvormi korral (Weberi sündroom) algab vananemine teismelistel ja haiged surevad 40-ndates eluaastates. Progeeriat põdevatel haigetel on telomeerid lühemad kui normaalsetel indiviididel.  

<tagasi

 

 

12. Transkriptsioon ja RNA protsessing

 

Geneetiline informatsioon kandub põlvkonnast põlvkonda salvestatuna DNA nukleotiidses järjestuses. Geenide avaldumine realiseerub informatsiooni edastamise teel DNA nukleotiidselt järjestuselt valkude aminohappelisse järjestusse. Esmalt kandub geneetiline informatsioon DNA-lt RNA-le – vastavat protsessi nimetatakse transkriptsiooniks. RNA molekulide nukleotiidses järjestuses salvestatud informatsiooni põhjal toimub valkude süntees – translatsioon. Seega liigub geneetiline informatsioon DNA-lt RNA-le ja RNA-lt valgule. Seda seaduspära nimetatakse molekulaarbioloogia põhidogmaks. Teatud viirustel, kelle genoomiks on RNA molekul (siia kuuluvad retroviirused, näiteks HIV), võib geneetiline informatsioon liikuda ka RNA-lt DNA-le. Informatsiooni liikumine RNA-lt valgule on aga alati ühesuunaline.

 

Transkriptsioon ja translatsioon

 

Transkriptsiooni käigus kasutatakse ühte DNA ahelatest matriitsina, et sünteesida sellele komplementaarne RNA ahel, mida nimetatakse transkriptiks. Näiteks kui matriitsahel DNA molekulis sisaldab nukleotiidset järjestust AAA, siis RNA molekulis vastab sellele järjestus UUU. Translatsiooni käigus „tõlgitakse“ RNA molekuli nukleotiidne järjestus valgu (polüpeptiidi) aminohappeliseks järjestuseks geneetilise koodi kaudu. RNA molekulis paiknevad nukleotiidide tripletid määravad ära, millised aminohapped lülitatakse translatsiooni käigus polüpeptiidahelasse. Näiteks UUU triplet RNA molekulis vastab aminohappele fenüülalaniin polüpeptiidahelas. Translatsioon toimub ribosoomidel. RNA molekuli, millelt toimub translatsioon, nimetatakse mRNA-ks (inglise keelest messenger RNA). Prokarüootsetes rakkudes on primaarne transkript üldjuhul ka koheselt transleeritav. Eukarüootses rakus toimub aga primaarse transkripti, pre-RNA, protsessimine transleeritavaks mRNA molekuliks. Enamus eukarüootseid geene rakutuumas sisaldavad endis mittekodeerivaid alasid – introneid, mis vahelduvad kodeerivate piirkondadega – eksonitega. Intronjärjestusi sisaldavatelt geenidelt sünteesitakse transkriptsiooni käigus pre-mRNA, millest seejärel kõrvaldatakse mittekodeerivad järjestused splaissingu (splicing) teel. Slaissingureaktsiooni läbiviimiseks moodustub makromolekulaarne struktuur, mida nimetatakse splaissosoomiks. Enne splaissimist lisatakse pre-mRNA-le 5´-otsa 7-metüülguanosiin ja 3´- otsa polü-A järjestus – polüA saba, mis on 20-200 nukleotiidi pikk. Kõik need protsessid toimuvad rakutuumas. Protsessitud mRNA transporditakse tsütoplasmasse ning alles seal toimub translatsioon. Erinevalt eukarüootidest, kus transkriptsioon ja translatsioon on ajaliselt ja ruumiliselt teineteisest lahutatud, toimuvad prokarüootsetes rakkudes mõlemad protsessid korraga: parasjagu sünteesitavalt mRNA molekulilt algab kohe ka translatsioon.

 

RNA molekulide tüübid

 

Eukarüootses rakus on põhiliselt nelja tüüpi RNA molekule: mRNA, tRNA, rRNA ja snRNA. Eelnevalt oli juttu mRNA molekulidest, mis kodeerivad valke. Nende ülesandeks on vahendada DNA nukleotiidses järjestuses salvestatud geneetilist informatsiooni translatsiooniaparaadile. tRNA molekulid (transfer RNAs) on väikesed RNA molekulid, mis toimivad adapteritena translatsioonil polüpeptiidahelasse lülitatavate aminohapete ja mRNA molekulis asuvate aminohappeid määravate koodonite vahel. Ribosomaalsed RNA molekulid (rRNA) kuuluvad ribosoomide koostisesse. Väikesed tuuma RNA-d (snRNA molekulid – small nuclear RNAs) osalevad intronite splaissingul. 

 

RNA süntees

 

RNA ahela polümerisatsioon toimub sarnaselt DNA ahela sünteesile: ka RNA ahela süntees toimub 5´→ 3´ suunas, mis tähendab, et fosfodiesterside moodustub RNA ahelasse viimasena lülitunud mononukleotiidi 3´-hüdroksüülrühma ja lisanduva nukleosiidtrifosfaadi 5´-fosfaatrühma reageerimisel. Võrreles DNA sünteesiga on aga ka mitmeid erinevusi:

(1)     RNA molekuli lülitatakse ribonukleosiid trifosfaate (DNA puhul desoksüribonukleosiid trifosfaate).

(2)     Iga konkreetse geeni puhul kasutatakse RNA sünteesiks matriitsina vaid ühte DNA ahelatest. RNA ahela pikendamine toimub lämmastikaluste komplementaarsuse põhimõttel, kuid erinevalt DNA sünteesist lülitatakse adeniini vastu mitte tümiin-nukleotiid vaid uratsiil-nukleotiid.

(3)     RNA sünteesiks ei ole vaja praimerit. Iga RNA molekuli süntees algab de novo, uue molekuli sünteesiga päris algusest.

 

RNA sünteesi viib läbi ensüüm, mida nimetatakse RNA polümeraasiks. Prokarüootsetes rakkudes on üks RNA polümeraas, eukarüootsetes aga kolm erinevat, mis teostavad erinevat tüüpi RNA molekulide sünteesi. RNA polümeraas algatab transkriptsiooni spetsiifilistelt DNA järjestustelt, mida nimetatakse promootoriks. Eukarüootsetes ja prokarüootsetes rakkudes on promootorjärjestused erinevad. Transkriptsiooni initsiatsiooni promootorilt reguleeritakse transkriptsioonifaktorite (negatiivsed või positiivsed regulaatorvalgud) seondumise kaudu promootorpiirkonda. Positiivsed regulaatorvalgud soodustavad ja negatiivsed regulaatorid pärsivad transkriptsiooni alustamist. Transkriptsioonimehhanismide kirjeldamisel kasutatakse DNA-s paiknevate regulatoorsete alade asukoha kirjeldamisel termineid „ülespoole“ ja „allapoole“ (ingl. keelest upstream ja downstream), mis tähendab, et need regioonid paiknevad käsiteldavast alast vastavalt kas kodeeriva DNA ahela (transkriptsioonil matriitsahelana toimiva DNA ahela vastasahel) 5´ või 3´ otsa suunas. Niisugune tähistus tuleneb sellest, et RNA süntees toimub alati 5´→ 3´ suunas. RNA sünteesi toimumiskohas on DNA ahelad RNA polümeraasi toimel teineteisest eraldunud. Vastavat struktuuri nimetatakse transkriptsioonimulliks. 

 

Transkriptsioon prokarüootses rakus

 

Bakterirakus sisaldavad enamus transkripte mitme erineva geeni järjestust. Geenid, mida transkribeeritakse korraga, kuuluvad ühte operoni (operoni kuuluvad ka nende geenide transkriptsiooni reguleerivad DNA järjestused) ja operonilt sünteesitud RNA molekuli nimetatakse polütsistroonseks RNA-ks. Transkriptsioonil eristatakse kolme erinevat staadiumi – initsiatsioon, elongatsioon ja terminatsioon.

 

RNA polümeraas, mis viib läbi transkriptsiooni, on multimeene valk. Holoensüüm koosneb viiest polüpeptiidist (subühikust): kaks α subühikut, β, β´ ja σ subühikud. Selline kompleks on vajalik transkriptsiooni initsiatsiooniks. Transkriptsiooni elongatsiooni viib läbi RNA polümeraasi apoensüüm, mis on tetrameerne ensüüm (α2 β β´). α-subühikud osalevad apoensüümi assambleerimisel ja nad võivad interakteeruda ka transriptsiooni aktivaatoritega. β-subühik on polümeraasse aktiivsusega ning β´ seondub DNA matriitsahelaga. Sigma faktori (σ) kuulumine RNA polümeraasi koosseisu võimaldab RNA polümeraasil  spetsiifiliselt „ära tunda“ ja seonduda promootoralale. Bakterirakus on mitmeid erinevaid sigma faktoreid, mis võimaldavad RNA polümeraasil seonduda erinevatele promootorjärjestustele. Transkriptsiooni elongatsioonil vabaneb sigma faktor RNA polümeraasi koosseisust.

 

Transkriptsiooni initsiatsioon

 

Transkriptsiooni initsiatsiooni võib omakorda jaotada kolmeks etapiks:

(1)     RNA polümeraasi holoensüümi seondumine promootorile;

(2)     DNA ahelate lokaalne lahtisulamine transkriptsiooni alguspunkti sisaldava ala piirkonnas, et matriitsahel saaks paarduda RNA ahelasse lülitatavate ribonukleotiididega;

(3)     Algab RNA ahela süntees, kus kasvavasse RNA ahelasse lülitatakse kuni 10 nukleotiidi, ilma et RNA polümeraas DNA ahelal edasi liiguks (abortiivne transkriptsioon). RNA polümeraas on DNA-l võimeline edasi liikuma alles siis, kui sigma faktor vabaneb. Siis algab RNA ahela elongatsioon.

 

Transkriptsiooni intsiatsiooni kohta DNA järjestusel (märgib nukleotiidi asukohta, millest algab esimese nukleotiidi lülitamine RNA ahelasse) tähistatakse +1. Kõigi nende nukleotiidide asukohti DNA-s, mis jäävad initsiatsioonisaidist „ülespoole“, seega 5´ suunas, näidatakse „-“ märgiga, mis aga jäävad „allapoole“, näidatakse „+“ märgiga.

 

Järgnevalt leiab täpsemat käsitlust bakteris Escherichia coli toimuv transkriptsiooni initsiatsioon. Bakteris E. coli (nii nagu ka teistes graam-negatiivsetes bakterites) on mitu erinevat sigma faktorit, millest põhiline on sigma70. See sigma faktor võimaldab ära tunda promootoreid, milles on konserveerunud kaks 6-nukleotiidset regiooni, mida nimetatakse –35 elemendiks ja –10 elemendiks (need järjestused paiknevad transkriptsiooni alguspunktist keskmiselt 35 ja 10 nukleotiidi kaugusel). –35 elemendis on konserveerunud (esinevad kõige sagedamini) nukleotiidid TTGACA, -10 elemendis aga TATAAT. DNA ahelate lahtisulamine transkriptsiooni initsiatsioonil hõlmab ka regiooni, kus paikneb A:T-rikas –10 element (DNA ahelad eralduvad teineteisest kergemini just A:T-rikastest piirkondadest!). –35 ja –10 heksameeride vaheline ala on enamasti 16-18 nukleotiidi ning selle nukleotiidne järjestus võib olla suvaline. Transkriptsiooni alguspunkt jääb –10 järjestusest 5-9 nukleotiidi allapoole. Valdavalt on esimeseks nukleotiidiks RNA ahelas (RNA molekuli 5´ otsas) puriin, seega kas adenosiin- või guanosiinnukleotiid.

 

Transkriptsiooni elongatsioon

 

RNA ahela elongatsiooni katalüüsib RNA polümeraasi apoensüüm, millest on dissotseerunud sigma faktor. Elongatsiooni käigus on DNA ahelad transkriptsiooni toimumise kohas teineteisest 18 aluspaari ulatuses eraldunud. RNA ahela polümerisatsioon toimub kiirusega 40 nukleotiidi sekundis. Sünteesitav RNA ahel eraldub DNA ahelast, vahetult transkriptsiooni toimumise kohas on DNA ja RNA aga kuni kolme nukleotiidi ulatuses paardunud. Transkriptsioonikompleksi stabiilsuse määrab eeskätt ära siiski mitte see paardumine, vaid DNA ja kasvava RNA ahela seondumine RNA polümeraasiga.

 

Transkriptsiooni terminatsioon

 

RNA ahela süntees lõpeb siis, kui RNA polümeraas kohtab terminatsioonisignaali. Seejärel transkriptsioonikompleks dissotseerub. Transkriptsiooni termineerivad signaalid on kas Rho valgust (r) sõltuvad või sõltumatud. Rho-sõltumatud terminaatorid sisaldavad G:C-rikast regiooni, millele järgneb 6 või enam A:T paari (A nukleotiidid asuvad matriitsahelas). Üksikahelaline RNA moodustab molekulisiseselt kergesti sekundaarstruktuure (omavahel paarduvad komplementaarsed üksikahelalised alad). Selline paardumine toimub ka terminatsioonisignaali sisaldavate G:C-rikaste piirkondade vahel parasjagu sünteesitavas RNA molekulis. Moodustunud sekundaarstruktuur kutsub esile RNA polümeraasi peatumise. Kui vahetult peale sellist sekundaarstruktuuri asub RNA molekulis pikk U-nukleotiididest koosnev järjestus, soodustab see RNA ahela dissotseerumist transkriptsioonikompleksist. Olgu veelkord rõhutatud, et võrreldes G:C aluste paardumisega (kolm vesiniksidet) on A:U paardumine (kaks vesiniksidet) nõrgem. Rho valgust sõltuva transkriptsiooni korral (nagu see toimub rRNA sünteesi puhul) on terminatsioonijärjestused (samuti G:C-rikkad, RNA ahelas enamasti C-nukleotiidid) pikemad. Sel juhul seondub Rho valk kasvava RNA ahelaga, liigub transkriptsioonikompleksile järgi ning kui RNA polümeraas aeglustub või peatub terminatsioonijärjestuste juures, jõuab Rho valk RNA polümeraasile järele ja eemaldab sünteesitud RNA ahela transkriptsioonikompleksist.

 

Transkriptsioon ja RNA protsessing eukarüootses rakus

 

Võrreldes bakterirakuga on transkriptsioon eukarüoodi rakus märksa komplekssem: RNA sünteesitakse tuumas, protsessitakse (pre-mRNA molekuli 5´ otsa lisatakse 7-metüülguanosiin, 3´ otsa polü-A saba ja splaissitakse) ning transporditakse seejärel tsütoplasmasse, kus toimub translatsioon  (vt. ka eestpoolt, kus on võrreldud eukarüootset ja prokarüootset transkriptsiooni).   

 

Rakutuumas sisalduv RNA on nii koostiselt kui ka pikkuselt väga heterogeenne (heterogeneous nuclear RNA – hnRNA). Suur osa sellest on mittekodeeriv, sisaldades pre-mRNA-st splaissingu tulemusena väljalõigatavaid intronjärjestusi, mis seejärel kiiresti degradeeritakse. Selleks, et kaitsta RNA-d ribonukleaaside (valgud, mis lagundavad RNA-d) eest, kaetakse RNA molekulid RNA-ga seonduvate valkude poolt. Selle tulemusena on eukarüootse RNA eluiga võrreldes prokarüootsega oluliselt pikem – poolestusajaga viis tundi võrreldes bakteri RNA keskmiselt mõne minuti pikkuse poolestusajaga.

 

RNA polümeraasid eukarüoodi rakus

 

Võrreldes bakteriraku RNA polümeraasiga on eukarüootsed RNA polümeraasid märksa komplekssemad, koosnedes enam kui kümnest subühikust. Erinevalt transkriptsiooni initsiatsioonist bakterites, kus paljudel juhtudel seondub RNA polümeraas promootoralale ka transkriptsioonifaktorite abita ja võib neist sõltumatult algatada ka transkriptsiooni, ei toimu eukarüootne transkriptsiooni initsiatsioon kunagi transkriptsioonifaktorite osaluseta.

 

 

Eukarüoodi rakus on kolm erineva funktsiooniga RNA polümeraasi:

(1)     RNA polümeraas I asub tuumakeses ja viib läbi ribosomaalse rRNA (v. a. 5S rRNA) sünteesi;

(2)     RNA polümeraas II asub rakutuumas ja katalüüsib kõigi pre-mRNA-de sünteesi;

(3)     RNA polümeraas III asub rakutuumas ning katalüüsib 5S rRNA, tRNA-de ja snRNA-de sünteesi.

 

Transkriptsiooni initsiatsioon eukarüoodi rakus

 

Enne, kui eukarüootne RNA polümeraas seondub promootoralale ja algatab transkriptsiooni, peavad sinna seonduma basaalsed transkriptsioonifaktorid. Erinevate RNA polümeraaside puhul on promootorelemendid ja sinna seonduvad transkriptsioonifaktorid erinevad. Järgnevalt tuleb põhjalikumalt juttu transkriptsiooni initsiatsioonist RNA polümeraas II puhul.

 

Nii nagu bakterirakus, on ka eukarüoodirakus transkriptsiooni initsiatsiooniks vajalik DNA ahelate lokaalne teineteisest eemaldumine. RNA polümeraasi II poolt äratuntavatel promootoritel on mitu konserveerunud elementi. Transkriptsiooni alguskohale kõige lähemal paikneb TATA element (ingl. k. TATA box), mille konsensusjärjestus on TATAAAA ja mille keskmine nukleotiid paikneb transkriptsiooni alguspunktist keskmiselt –30 nukleotiidi kaugusel. Järgmine konserveerunud element CAAT konsensusjärjestusega GGCCAATCT asub kaugusel –80 nukleotiidi transkriptsiooni alguspunktist. Lisaks on promootoralas sageli veel GC element konsensusega GGGCGG ja oktameerne järjestus konsensusega ATTTGCAT.

 

Basaalseid transkriptsioonifaktoreid tähistatakse TFIIX (transcription factor for polymerase II), kus X-I asemel on täht, mis eristatab individuaalseid transkriptsioonifaktoreid. Esmalt seondub promootorile TFIID, millesse kuuluvad TATA-elemendiga seonduv valk TBP (TATA-binding protein) ja mitu väikest TBP-ga assotsieerunud valke. Seejärel lisanduvad TFIIA ja TFIIB. TFIIF assotsieerub esmalt RNA polümeraasiga ja järgnevalt liituvad TFIIF ja RNA polümeraas II teiste valkudega, moodustades transkriptsiooni initsiatsiooni kompleksi. DNA ahelate lahtikeerdumine transkriptsiooni initsiatsioonikohas toimub TFIIF abil.

 

RNA ahela elongatsioon

 

Kui RNA polümeraas vabaneb basaalsetest transkriptsioonifaktoritest promootorpiirkonnas, järgneb RNA ahela elongatsioon sarnaselt bakterirakus toimuvale. Sünteesitava RNA ahela 5´ otsa modifitseerimine toimub juba elongatsiooni varajasel etapil. 5´ otsa lisatav 7-metüülguanosiin “müts” (7-methyl guanosine cap) sisaldab ebatavalist 5´-5´- trifosfaatsidet ja kahte metüülrühma. Selline struktuur RNA molekuli otsas on äratuntav translatsiooni initsiatsioonil osalevate valkude poolt, samuti kaitseb see mRNA-d degradatsiooni eest. 

 

Transkriptsiooni terminatsioon

 

RNA polümeraas II poolt sünteesitud primaarsete transkriptide 3´-otsad lõigatakse spetsiifiliste endonukleaaside abil lühemaks. Transkriptsiooni termineerumine toimub neist lõikekohtadest (lõikesaitidest) 1000 – 2000 nukleotiidi allpool, kusjuures kindlat termineerumiskohta ei ole. Enamasti jääb lõikesait 11-30 nukleotiidi allapoole konserveerunud järjestusest AAUAAA. Pärast lõikust lisab ensüüm polü(A) polümeraas RNA molekuli 3´-otsa polü-A saba, mis koosneb kuni 200-st adenosiinmonofosfaadist. Polü-A sabad suurendavad mRNA molekulide stabiilsust ja neil on ka oluline roll RNA transpordil tuumast tsütoplasmasse.

 

Erinevalt RNA polümeraasist II tunnevad polümeraasid I ja III ära kindlaid terminatsioonisignaale. Polümeraas I lõpetab transkriptsiooni, kui saab signaali 18 nukleotiidi pikkuselt järjestuselt, kuhu on seondunud terminaatorvalk. RNA polümeraasi III puhul toimub transktiptsiooni termineerumine sarnaselt bakterites toimuva Rho-valgust sõltuva terminatsiooniga.

 

Eukarüootsete geenide struktuur

 

Eelpool oli põgusalt juttu sellest, et enamasti paiknevad eukarüootsetes geenides kodeerivate alade vahel mittekodeerivad alad, mida nimetatakse introniteks (tuletatud terminist intervening sequences). Neid geenijärjestusi, mis jäävad mRNA koostisesse pärast splaissingut, nimetatakse eksoniteks (expressed sequences). 

 

Intronite olemasolu tõestati esmakordselt imetajate b-globiini geeni puhul, vaadeldes DNA ja mRNA vahelisi hübriide elektronmikroskoobis. Hiire b-globiini mRNA, mis oli eraldatud tsütoplasmast, hübridiseerus vastavat geeni sisaldava DNA-ga ainult osades piirkondades, moodustades RNA-DNA dupleksi, kusjuures teine DNA ahel selles piirkonnas oli nähtav eraldi väljaulatuva linguna. Vastavaid struktuure nimetatakse R-lingudeks (R-loop). Erinevalt tsütoplasmast eraldatud mRNA-st oli tuumast eraldatud b-globiini RNA puhul DNA ja RNA vaheline hübridisatsioon enamasti täielik. Need katsed viitasid sellele, et algsest RNA-st lõigatakse teatud segmendid välja ja seejärel viiakse lõikusejärgne RNA tsütoplasmasse.

 

Intronite sisaldus ja pikkus varieerub geeniti. Intronite pikkus võib varieeruda 50-st nukleotiidist tuhandeteni. b-globiini geeni puhul on leitud kaks intronit, mis eraldavad üksteisest kolme eksoni. Näiteks kollageeni geen on aga ligikaudu 10 korda pikem kui temas sisalduvate eksonite kogupikkus. Seni kõige pikem geen, DMD geen, on leitud inimesel (mutatsioonid selles geenis põhjustavad Duchenne lihasdüstroofiat). DMD geen on 2,5 miljoni nukleotiidi pikkune ja sisaldab 78 intronit. Arvatakse, et mõned intronid võivad sisaldada regulatoorseid alasid, mis mõjutavad geenide avaldumist. Alternatiivse splaissingu tagajärjel (splaissingu tulemusena võidakse välja lõigata ka osa eksoneid) võib saada erinevate funktsioonidega valke.

 

Intronite kõrvaldamine splaissingu teel

 

Selleks, et splaissitud mRNA kodeeriks funktsionaalset valku, peab splaissingu protsess toimuma väga täpselt. Struktuurvalke kodeerivates, rakutuumas asuvates geenides paiknevate intronite otstes on lühikesed konserveerunud alad. 100%-liselt on konserveerunud dinukleotiidid GT intronist 5´ suunda jääva eksoni kõrval ja AG intronist 3´ suunda jääva eksoni kõrval. Nendest intronisse sissepoole jäävad vähemkonserveerunud alad. Üks neist on TACTAAC element, mis jääb introni 3´ splaissingu saidist 30 nukleotiidi ülepoole. Ekson-intron ühendusalade järjestus tRNA-de geenides ning struktuurgeenide puhul mitokondrites ja kloroplastides erineb eelpoolkäsitletust. Nende puhul on ka splaissingumehhanism teistsugune. 

 

Intronite väljalõikamine võib toimuda kolme erineva mehhanismi alusel:

 

(1)     tRNA prekursorite puhul teeb katked RNA ahelasse spetsiifiline splaissingu endonukleaas ning eksoneid sisaldavad RNA segmendid ühendatakse splaissingu ligaasi abil. Need ensüümid tunnevad spetsiifiliselt ära tRNA prekursormolekuli kõrgemat järku struktuuri, mitte aga spetsiifilist nukleotiidset järjestust.

 

(2)     Osade rRNA prekursorite puhul (paljudes madalamates eukaüootides, näit. Tetrahymena thermophila samuti ka rakuorganellides) kõrvaldatakse intronid autokatalüütiliselt, RNA molekuli enda poolt. Splaissingureaktsioon ei vaja välist energiaallikat ega valkude aktiivsust. Kofaktorina on vaja vaba 3´-OH rühma kas GTP-lt, GDP-lt, GMP-lt või guanosiinilt (G-3´-OH) ning monovalentset ja divalentset katiooni. Splaissing toimub etapiviisiliselt: kõigepealt toimub fosfodiestersideme ülekanne ekson-intron ühendusalalt G-OH-le (RNA ahela katkeb eksoni ja introni ühendusalas), seejärel katkeb fosfodiesterside järgmise eksoni ja introni 3´-otsa vahel ning fosfodiesterside moodustub eksonite vahel. Väljälõigatud intron tsirkulariseerub molekulisiseselt (toimub veel üks fosfodiestersideme ülekanne).

 

(3)     Rakutuumas asuvate pre-mRNA molekulide splaissing toimub kahe-etapiliselt ribonukleoproteiin-partiklites – splaissosoomides. Splaissosoomid sisaldavad snRNA molekule U1-U6 (U3 asub tuumakeses) ja üle 40 erineva valgu. snRNA-d ei ole tumas vabalt, vaid kuuluvad väikestesse RNA-valk kompleksidesse, mida nimetatakse snRNP-deks (small nuclear ribonucleoproteins). Splaissing toimub etapiviisiliselt. Esmalt katkestatakse fosfodiesterside introni 5´-splaissingu saidis introni GU järjestusest 5´-suunas. Protsessis osaleb kogu splaissosoom. Splaissingu saiti seondub otseselt U1 snRNP. Fosfodiesterside moodustub introni 5´-otsa ja konserveerunud A nukleotiidi vahel introni 3´-otsa lähedal. Seejärel seondub U2 snRNP introni splaissingu 3´-saiti, kus konserveerunud A nukleotiid on ühenduses introni 5´-otsaga (selliseid struktuure nimetatakse lariaatideks). Kompleksile lisanduvad ka teised snRNP-d, et moodustuks täielik splaissosoom ning seejärel lõigatakse intron 3´- splaissingusaidist välja (fosfodiestersideme lõhkumine) ja eksonite vahel moodustub fosfodiesterside.

 

mRNA molekulis asuva geneetilise informatsooni muutmine – RNA editing

 

Geneetilist informatsiooni RNA molekulis võidakse muuta kahel viisil, lämmastikaluste asendamise teel ja lisades või deleteerides U nukleotiide.

 

Lämmastikaluste asendamist on täheldatud peamiselt taimede mitokondrites ja valdavaks muutuseks on C asendamine U-ga, kus RNA-ga järjestusspetsiifiliselt seonduv valk kõrvaldab tsütosiinilt aminorühma. Selline muutus leiab aset ka inimese ja küüliku apolipoproteiini pre-mRNA-s, kus C konverteerimine U-ks tekitab mRNA molekuli keskele translatsiooni stop koodoni UAA.

 

Nukleotiidide lisamine või deleteerimine on võrreldes lämmastikaluste asendamisega komplekssem protsess. Seda protsessi on kirjeldatud eeskätt trüpanosoomide mitokondrites (näit. algloom Leishmania tarentolae, kes põhjustab inimestel unetõbe). mRNA molekuli koostisesse lisatakse uridiinmonofosfaate. Nukleotiidide sisestamiskohti sisaldava mRNA piirkonnaga paardub mRNA vastava kohaga osaliselt homoloogiline RNA molekul, mida nimetatakse giid-RNA-ks (ingl. k. guide RNA). Giid-RNA-s asuvad mRNA-ga mittepaarduvates alades A nukleotiidid ja just nende vastu lisatakse mRNA-s uridiinmonofosfaadid.

 

Kuigi RNA editingi bioloogiline tähtsus on seni veel väljaselgitamisel, on selge, et see protsess mõjutab oluliselt geenide avaldumistaset trüpanosoomide ja taimede mitokondrites.  

 

<tagasi

 

13. Translatsioon ja geneetiline kood

 

Polüpeptiidide struktuur

 

Erinevad geenid kodeerivad erinevaid polüpeptiide. Polüpeptiidahelates on aminohapped omavahel ühendatud kovalentsete sidemete kaudu. Rakus on 20 erinevat aminohapet. Kõigil aiminohapetel v.a. proliin on aminorühm ja karboksüülrühm. Aminohapped eristuvad üksteisest rühma (ingl. k. side group) poolest, mis võib erinevatel aminohapetel olla kas:

1)       hüdrofoobne või mittepolaarne;

2)       hüdrofiilne  või polaarne;

3)       happeline või negatiivselt laetud;

4)       aluseline või positiivselt laetud.

Just nende rühmade varieeruvus tagab individuaalsete valkude struktuursed ja funktsionaalsed iseärasused. Aminohapped on polüpeptiidahelas ühendatud kovalentselt, peptiidsidemete kaudu. Peptiidside kahe aminohappe vahel moodustub ühe aminohappe aminorühma ja teise aminohappe karboksüülrühma reageerimisel. Peptiidsideme moodustumisel eraldub vee molekul. Valkude funktsiooni seisukohalt on oluline nende ruumiline struktuur. Polüpeptiidahela primaarstruktuuri kirjeldab tema aminohappelin järjestus. Polüpeptiidahelasse lülitunud aminohapped võivad molekulisiseselt omavahel mitmel viisil interakteeruda (moodustuvad vesiniksidemed ja disulfiidsillad, mittepolaarsete gruppide vahel tekivad hüdrofoobsed interaktsioonid, olulised on ka Van der Waalsi interaktsioonid lähestikku paiknevate aatomite vahel). Polüpeptiidahelate sekundaarstruktuuris on kõige tavalisemaks α-heeliksite (α-helixes) ja β-lehede (β-sheets) moodustumine vesiniksidemete abil. Vesiniksidemed tekivad lähestikku paiknevate peptiidsidemete vahel. Valgu üldine konformatsioon on tagatud aga polüpeptiidi tertsiaar- ja/või kvaternaarstruktuuri tekke kaudu. Kvaternaarstruktuuri näeme siis, kui omavahel on assotsieerunud kaks või enam polüpeptiidi.

 

Valgusüntees

 

Valgusünteesiaparaat on väga kompleksne. Valgusünteesil osalevad molekulid moodustavad kuni 1/3 raku kuivmassist. Valgusüntees toimub ribosoomidel, mis koosnevad 3-5 erinevast rRNA molekulist ja üle 50 erinevast ribosoomivalgust. Lisaks osaleb translatsioonil 40-60 erinevat tRNA molekuli, vähemalt 20 erinevaid aminohappeid aktiveerivat ensüümi ja terve rida translatsioonifaktoreid, valke, mida on vaja translatsiooni initsiatsioonil, elongatsioonil ja terminatsioonil. Bakterirakus ei ole ribosoomidel kindlat asukohta, eukarüootses rakus paiknevad nad aga tsütoplasmas ja on enamasti endoplasmaatilise retiikulumi pinnal.

 

mRNA molekuli nukleotiidne järjestus transleeritakse polüpeptiidi aminohappeliseks järjestuseks vastavalt geneetilisele koodile, mille alusel vastab igale aminohappele kas üks või mitu koodonit. Koodonid koosnevad kolmest nukleotiidist (nukleotiidide tripletist). 64-st võimalikust nukleotiidide tripletist 61 kodeerivad aminohappeid ja 3 on signaaliks translatsiooni terminatsioonile. tRNA molekulid sisaldavad nukleotiidide tripleteid, mida nimetatakse antikoodoniteks. Translatsioonil paarduvad tRNA molekulid mRNA molekulis asuvate koodonitega antikoodonite vahendusel. Erinevad aminohapped seonduvad erinevate tRNA molekulidega. Igale aminohappele vastab rakus üks kuni neli erinevat tRNA molekuli. Aminohapped seotakse tRNA molekulide külge aminoatsüül-tRNA-süntetaaside abil. Iga mRNA molekul on samaaegselt transleeritav paljudel ribosoomidel – polüribosoomil. 

 

Ribosoomide ehitus

 

Ribosoomid koosnevad suurest ja väikesest alaosast e. subühikust. Ribosoomi alaosad eralduvad teineteisest, kui mRNA molekul on transleeritud ja ühinevad uuesti translatsiooni initsiatsioonil. Ribosoomi komponentide suurust väljendatakse tavaliselt Svedbergi ühikutes, mis vastab nende komponentide sedimentatsiooni kiirusele tseesiumkloriidi gradiendis tsentrifuugimisel. Bakterirakus asuvad ribosoomid on suurusega 70S (molekulmassiga 2,5 x 106). Eukarüootide tsütoplasmas asuvad ribosoomid on suurusega 80S ning mitokondrites ja kloroplastides paiknevad ribosoomid suurusega 60S. Samas on ribosoomide kolmemõõtmeline struktuur üldjoontelt sarnane kõigis elusorganismides.

 

Bakteri ribosoomide väike subühik suurusega 30S koosneb 16S rRNA molekulist ja 21-st erinevast polüpeptiidist. Suur subühik (50S) sisaldab kahte RNA molekuli (5S rRNA ja 23S rRNA) ning 31 erinevat polüpeptiidi.

 

Eukarüootsed ribosoomid koosnevad 40S väikesest subühikust, milles on 18S RNA ja 33 erinevat ribosoomivalku ning 60S suurest subühikust, milles on kolm rRNA molekuli (5S rRNA, 5,8S rRNA, 28S rRNA) ja 49 polüpeptiidi. Eukarüootides sünteesitakse rRNA tuumakeses RNA polümeraasi I poolt. Tuumake on osa rakutuumast, mis on spetsialiseerunud rRNA sünteesiks ja rRNA assambleerimiseks ribosoomidesse.

 

rRNA eellasmolekulid on tunduvalt pikemad kui nende protsessinguproduktid ribosoomides. Bakterirakus sünteesitakse esmalt 30S prekursor, mis seejärel lõigatakse endoribonukleaasi III toimel 5S, 16S ja 23S rRNA molekulideks ja üheks tRNA molekuliks. Imetajarakkudes lõigatakse 45S prekursor 5,8S, 18S ja 28S rRNA-deks ning 5S rRNA protsessitakse ühest teisest transkriptist. Lisaks metüleeritakse rRNA molekule paljudest kohtadest, et kaitsta neid näiteks ribonukleaaside poolse degradatsiooni eest.

 

Kuna ribosoomide hulk raku kohta on väga suur, on ka rRNA-d kodeerivate geenide koopiaarv raku kohta kõrge. Eukarüootides on neid geene sadu kuni tuhandeid koopiaid ning nad paiknevad genoomis järjestikuliselt, moodustades kromosoomides tuumakest organiseerivaid regioone (nucleolar organizer regions). Inimesel on need regioonid lokaliseerunud kromosoomide 13, 14, 15, 21 ja 22 väikesesse õlga. Samas on 5S rRNA geenid jaotunud ühtlaselt erinevatesse kromosoomidesse. Ka bakterite rRNA geene on mitu koopiat. E. coli rakkudes on neid 7 koopiat. 

 

tRNA molekulid

 

Aminohape seotakse tRNA molekuli 3´-hüdroksüülrühma külge aminohappe karboksüülrühma kaudu. Vastavat protsessi nimetatakse tRNA aktiveerimiseks e. aminohappega laadimiseks ning see toimub kahe-etapiliselt. Esmalt aktiveerivad aminoatsüül-tRNA süntetaasid (kõigile 20-le erinevale aminohappele on rakus vähemalt üks spetsiifiline aminoatsüül-tRNA süntetaas) aminohapped, kasutades selleks ATP energiat: saadakse AMP-ga seondunud aminohape ja eraldub pürofosfaat. Seejärel seotakse aminohape tRNA molekuliga, moodustub aminoatsüül-tRNA (näit. alaniiniga aktiveeritud tRNA on alanüül-tRNAAla) ja eraldub AMP. Iga spetsiifiline aminoatsüül-tRNA-süntetaas tunneb ära teatud aminohappele vastavaid tRNA molekule. 

 

tRNA molekulid on väikesed, 70-80 nukleotiidi pikkused molekulid, mille sekundaarstruktuur on ristikheina lehe kujuline (kolm juuksenõelastruktuuri ja vars). Kolmemõõtmeline struktuur on L-tähe kujuline. Antikoodooni ling asub molekuli keskel. tRNA geenid kodeerivad tRNA-de prekursormolekule, mis transkriptsioonijärgselt lõigatakse lühemaks, viiakse õigesse konformatsiooni, metüleeritakse. Valmis tRNA molekulid sisaldavad ka mitmeid ebatavalisi nukleotiide nagu näiteks inosiin, pseudouridiin, dihüdrouridiin, 1-metüülguanosiin jne., mis lülitatakse RNA koostisesse kas transkriptsiooni käigus või saadakse transkriptsioonijärgselt ensümaatiliste reaktsioonide abil.

 

Eksperimentaalsed tõendid selle kohta, et aminoatsüül-tRNA kompleksi koodoni-spetsiifilisus on tagatud tRNA ja mitte aminohappe poolt, saadi sel viisil, et muudeti tsüsteüül-tRNACys koostises olev tsüsteiin keemilise reaktsiooni abil alaniiniks ja uuriti, kumba aminohapet (tsüsteiini või alaniini) sel juhul polüpeptiidahelasse lülitatakse. Selgus, et modifitseeritud alanüül-tRNACys lisamisel in vitro translatsiooni reaktsiooni lülitati mRNA-s asuvate tsüsteiini koodonite kohal polüpeptiidi tsüsteiini asemel alaniini.

 

tRNA saab ribosoomis seonduda kolme saiti. Esmalt seondub aminoatsüül-tRNA aminoatsüül-saiti e. A-saiti. Peptidüül-saidis e. P-saidis toimub aminohappe lisamine kasvavale polüpeptiidahelale. E-saiti (exit site) liigub tRNA, millelt aminohape on seotud polüpeptiidahelasse. Nende seondumissaitide põhiosa asub ribosoomi suures subühikus, samas kui mRNA (milles asuvad koodonid määravad ära, milline aminoatsüül-tRNA parasjagu  mRNA-le seondub) on ribosoomi väikese subühiku koostises.

 

 

Translatsiooni initsiatsioon

 

Translatsiooni initsiatsiooni alla koondatakse kõik need sündmused, mis eelnevad peptiidsideme moodustumisele sünteesitava polüpeptiidi kahe esimese aminohappe vahel. Kuigi paljud initsiatsiooonimehhanismid bakterites ja eukarüoodirakkudes on sarnased, on ka erinevusi.

 

Bakteris E. coli on translatsiooni initsiatsiooni alguseks vaja ribosoomi 30S subühikut, mRNA-d, spetsiaalset initsiaator-tRNA-d, kolme initsiaatorfaktorit (valgud IF-1, IF-2, IF-3) ja GTP molekuli. Translatsioon toimub 70S ribosoomidel, kuid enne translatsiooni toimumist on ribosoomid jaotunud kaheks alaühikuks – 30S ja 50S subühikuteks. Translatsiooni initsiatsioonikoodoniks mRNA molekulis on AUG koodon. Sellest 7 nukleotiidi ülespoole jääb polüpuriinjärjestus konsensusega AGGAGG. See järjestus on komplementaarne ribosoomi 16S rRNA 3´-otsa lähedal paikneva nukleotiidse järjestusega (paardub sellega), mistõttu seda mRNA järjestust nimetatakse kas RBS-ks (ribosome binding site) või Shine-Dalgarno järjestuseks (nimetatud teadlaste järgi, kes selle mehhanismi avastasid). Shine-Dalgarno järjestuse puudumisel mRNA-d ei transleerita või transleeritakse väga vähe. Ribosoomi 30S subühik ja mRNA moodustavad kompleksi ainult IF3 juuresolekul.  

 

Polüpeptiidi sünteesi initsiatsioonil osaleb spetsiaalne tRNA molekul – metionüül-tRNAfMet, mis tunneb ära translatsiooni initsiaatorkoodoni AUG (harva on selleks GUG, mis mRNA muudes positsioonides kodeerib valiini) ja viib ribosoomi formüülmetioniini (metioniini, mille aminorühm on blokeeritud formüülrühmaga). Metionüül-tRNAfMet interakteerub initsiatsioonifaktoriga IF-2.

 

Täielik initsiatsioonikompleks moodustub metionüül-tRNAfMet/IF-2 ning mRNA/30S subühik/IF-3 komplekside kombineerumisel IF-1 ja GTP juuresolekul. Seejärel lisandub ribosoomi 50S subühik, kuid eelnevalt peab IF-3 kompleksist vabanema. 50S subühiku liitumisel 30S subühikuga tarbitakse GTP energiat ning kompleksist vabanevad IF-1, IF-3 ja GDP. Metionüül-tRNAfMet liigub nüüd ribosoomi peptidüül-saiti (P-saiti), olles seondunud antikoodoniga initsiaatorkoodonile AUG mRNA molekulil. Metionüül-tRNAfMet on ainuke aminoatsüül-tRNA molekul, mis liigub otse P-saiti, ilma et oleks eelnevalt läbinud A-saidi. Kui metionüül-tRNAfMet on jõudnud P-saiti, on mRNA-s AUG kõrval asuv koodon ribosoomi A-saidis valmis vastu võtma aminoatsüül-tRNA molekuli, mis sisaldab sellele koodonile vastavat antikoodonit.

 

Eukarüootides on translatsiooni initsiatsioon võrreldes bakterites toimuvaga komplekssem ja seda eeskätt initsiatsioonifaktorite rohkuse tõttu. Üldiselt on initsiatsiooniprotsess aga sarnane, välja arvatud kaks erinevust:

1)       Polüpeptiidahelasse esimesena lülitatava metioniini aminorühm ei ole blokeeritud formüülrühmaga;

2)       Initsiatsioonikompleks moodustub mRNA 5´-otsaga. Ei ole vaja spetsiifilist järjestust mRNA molekuli alguses, mis paarduks rRNA-ga ribosoomis, vaid initsiatsioonifaktorite hulgas on spetsiifiline valk CBP (cap-binding protein), mis seondub mRNA 5´-otsas oleva 7-metüülguanosiiniga ning edasi skanneerib initsiatsioonikompleks mRNA-d kuni esimese AUG koodonini. Seetõttu algab eukarüootides translatsioon enamasti esimeselt AUG koodonilt.

 

Nii nagu prokarüootides, on ka eukarüootides olemas spetsiifiline initsiaator-tRNA, tRNAiMet, kus i tähendab initsiaatorit.

 

Translatsiooni elongatsioon

 

Translatsiooni elongatsiooni üldised printsiibid on eukarüootidel ja prokarüootidel sarnased, iga aminohappe lisamine kasvavasse polüpeptiidahelasse toimub kolmeetapiliselt. Bakteris E. coli toimub see järgmiselt:

1)       Aminoatsüül-tRNA seondub ribosoomi A-saiti, paardudes antikoodonjärjestuse kaudu parasjagu A-saidis asuva koodonjärjestusega mRNA molekulis. Selleks peab aminoatsüül-tRNA olema assotsieerunud elongatsioonifaktoriga EF-Tu, mis on seotud GTP-ga.

2)       Peptiidsideme moodustumine ribosoomi A-saidis asuva aminoatsüül-tRNA aminorühma ja ribosoomi P-saidis asuva tRNA-ga seotud kasvava polüpeptiidahela viimase aminohappe karboksüülrühma vahel. Selle tulemusena vabaneb kasvav polüpeptiidahel tRNA-st P-saidis ja seotakse kovalentselt tRNA-ga, mis asub A-saidis. Reaktsiooni katalüüsib peptidüültransferaas, mille aktiivsus on tagatud ribosoomi 50S subühikus asuva 23S rRNA molekuli poolt. Peptiidsideme moodustumiseks on vaja EF-Tu koostises oleva GTP hüdrolüüsi. Peale GTP hüdrolüüsi vabaneb EF-Tu~GDP ribosoomilt. Tagasi aktiivsesse vormi viib EF-Tu~GDP elongatsioonifaktor EF-Ts. Selle protsessi käigus hüdrolüüsitakse jällegi üks GTP molekul ja tekib EF-Tu~GTP.

3)       Ribosoomi A-saidis asuv aminoatsüül-tRNA liigub P-saiti ja enne seda P-saidis asunud tRNA, mis ei ole enam aminohappega seotud, liigub E-saiti. Ribosoom liigub mRNA molekulil kolme nukleotiidi võrra edasi mRNA 3´-otsa suunas ning A-sait jääb vabaks, seondumaks järgmise aminoatsüül-tRNA molekuliga. Translokatsioonil osaleb elongatsioonifaktor EF-G ja protsess tarbib jällegi GTP energiat.

 

Polüpeptiidahela elongatsioon toimub kiiresti. Bakteris E. coli kulub eelpoolkirjeldatud kolme etapi läbimiseks 0,05 sekundit. Seega kulub 300 aminohappe pikkuse polüpeptiidi sünteesiks ligikaudu 15 sekundit.

 

Translatsiooni terminatsioon

 

Polüpeptiidahela elongatsioon termineerub, kui ribosoomi A-saiti satub üks kolmest terminatsioonikoodonist, UAA, UAG või UGA. Stop-koodoneid tunnevad ära terminatsioonifaktorid, milleks on valgud tähistusega RF (release factor). Bakteris E. coli on kaks RF-i: RF-1 tunneb ära UAA ja UAG terminatsioonikoodoneid ning RF-2 UAA ja UGA terminatsioonikoodoneid. Eukarüootides on ainult üks RF (eRF), mis tunneb ära kõiki terminatsioonikoodoneid. A-saiti sisenenud RF muudab peptidüültransferaasi aktiivsust, nii et peptidüültransferaas lisab polüpeptiidahela viimase aminohappe karboksüülrühmale vee molekuli. Selle tulemusena vabaneb valmis polüpeptiidahel P-saidis asuvalt tRNA molekulilt ning vaba tRNA liigub ribosoomi E-saiti. Translatsiooni terminatsiooniprotsess lõpeb mRNA vabanemisega ribosoomilt ja ribosoomi jaotumisega kaheks alaosaks. Seejärel on ribosoomi subühikud jällegi valmis ühinema järgmise polüpeptiidahela sünteesiks.

 

Geneetiline kood

 

Geneetilise koodi põhimõte selgitati välja 1960-ndatel aastatel. Suur osa oli selles Francis Crick’i ja tema kolleegide uurimistööl, kus viidi läbi katseid erinevate bakteriviiruste mutantidega ja uuriti, mitme nukleotiidi lisamine või deleteerimine taastab algse fenotüübi.  Geneetilisele koodile on iseloomulikud järgmised omadused:

1)       Geneetiline kood põhineb nukleotiidide tripletitel: kolm nukleotiidi, mis moodustavad koodoni, määravad ära ühe aminohappe polüpeptiidis;

2)       Geneetiline kood ei ole kattuv: iga nukleotiid mRNA molekulis kuulub ainult ühte koodonisse (v.a. erandjuhtumid, kus tegemist on kattuvate geenidega, mis kodeerivad erinevaid valke);

3)       Geneetiline kood on komavaba: pole väljajäetavaid nukleotiide, kõik mRNA-s asuvad koodonid loetakse translatsioonil järjest, ühes lugemisraamis (reading frame);

4)       Geneetiline kood on degenereerunud e. kõdunud: peaaegu kõigile aminohapetele vastab enam kui üks koodon;

5)       Geneetiline kood on seaduspärane (ingl. k. ordered): teatud aminohapet määravad koodonid ja sarnaseid aminohappeid määravad koodonid on oma nukleotiidselt järjestuselt sarnased ja erinevad sageli üksteisest vaid ühe nukleotiidi poolest;

6)       Geneetilisse koodi kuuluvad spetsiifilised koodonid, mis on signaaliks translatsiooni initsiatsioonile ja terminatsioonile;

7)       Geneetiline kood on (v.a. mõned erinevused mitokondrites) universaalne kõigile elusorganismidele.

 

Geneetilise koodi lahtimuukimiseks kasutati peamiselt kahte tüüpi katseid. Näiteks uuriti, milliseid aminohappeid lülitatakse polüpeptiidi in vitro translatsioonil, kui kasutada matriitsina laboris sünteesitud kindla nukleotiidse järjestusega mRNA-sid. Siin olid läbimurdeks Marshall Nirenbergi (sai 1968. a. Nobeli preemia) ja Heinrich Matthaei uurimistööd. Näiteks lisades in vitro translatsioonisüsteemi (saadi purustatud rakkudest rakuvaba lüsaadi tegemisel, sisaldas ribosoome ja translatsioonifaktoreid) sünteetilisi mRNA molekule, kas polü-U, polü-A või polü-C mRNA-sid ning radioaktiivse süsinikuga märgistatud fenüülalaniini, nähti, et polü-fenüülalaniin moodustus ainult polü-U lisamisel translatsioonireaktsiooni. Sarnaseid katseid tehti ka teiste märgistatud aminohapete lisamisel reaktsiooni, varieerides samuti ka sünteetiliste mRNA-de nukleotiidseid järjestusi. 1964. a. töötasid Nirenberg ja Leder välja meetodi, mis võimaldas siduda ribosoomidega erinevaid aminoatsüül-tRNA molekule. Nad lisasid translatsioonireaktsiooni kolme nukleotiidi pikkusi kindla nukleotiidse järjestusega mini-mRNA-sid ja uurisid, millised aminoatsüül-tRNA molekulid milliste mini-mRNA-de puhul ribosoomidega seonduvad. Näiteks trinukleotiidid 5´-UUU-3´ ja 5´-UUC-3´ stimuleerisid mõlemad fenüülalanüül-tRNAPhe seondumist ribosoomidele, mis viitas sellele, et UUU ja UUC on fenüülalaniini koodonid. Sel viisil oli võimalik läbi testida kõik 64 võimalikku trinukleotiidide kombinatsiooni ja vaadelda, milliste aminoatsüül-tRNA molekulide seondumist ribosoomidele nad stimuleerivad.

 

Kõik aminohapped v.a. metioniin ja trüptofaan on määratud enam kui ühe koodoni poolt. Leutsiinil, seriinil ja arginiinil on kuus erinevat koodonit, teistel vähem. Geneetiline kood võib olla kõdunud kas täielikult või osaliselt. Osalise kõdumise korral võib nukleotiidi asendus koodoni kolmandas positsioonis (puriin pürimidiiniks või vastupidi) tekitada koodoni, mis vastab teisele, eelmisele keemilistelt omadustelt lähedasele aminohappele. Näiteks sarnaste aminohapete leutsiin, isoleutsiin ja valiin koodonid erinevad üksteisest vaid nukleotiidi poolest koodoni kolmandas positsioonis. Täieliku kõdumise korral võib koodoni kolmandas positsioonis olla suvaline nukleotiid, ilma et see muudaks aminohapet.

 

Nii prokarüootides kui ka eukarüootides on initsiaatorkoodoniks AUG (harva GUG). Initsiaatorkoodon tuntakse ära initsiaator-tRNA poolt (tRNAfMet bakterites ja tRNAiMet eukarüootides). Bakterites peab AUG initsiaatorkoodonile mRNA molekulis eelnema Shine-Dalgarno järjestus (vt. ka eestpoolt translatsiooni initsiatsiooni erinevusi prokarüootses ja eukarüootses rakus).

 

Kolm koodonit UAG, UAA ja UGA on signaaliks translatsiooni termineerumisele. Neid stop koodoneid nimetatakse amber, ochre ja opal koodoniteks. Mitokondrites ei kehti geneetilise koodi universaalsus. Seal ei ole UGA stop koodon, vaid seda loetakse trüptofaani koodonina. AGA ja AGG, mis üldiselt on arginiini koodonid, tuntakse mitokondrite ribosoomidel ära stop koodonitena. Lisaks, kui AUA mujal kodeerib isoleutsiini, siis mitokondrites kodeerib ta metioniini.

 

Koodon-tRNA interaktsioonid

 

Teatud aminohape seondub ainult talle spetsiifiliste tRNA molekulidega. aminoatsüül-tRNA interakteerub antikoodonjärjestuse abil mRNA molekulis asuva koodoniga, mis vastab sellele aminohappele, millega tRNA on seotud. tRNA antikoodonjärjestus paardub mRNA-s asuva koodonjärjestusega koodoni kahe esimese nukleotiidi osas väga täpselt, vastavuses lämmastikaluste komplementaarsuse põhimõttele. Koodoni kolmandas positsioonis asuva nukleotiidiga paardumine on aga ebatäpne, mistõttu seda saiti koodonis nimetatakse lõdvaks (ingl. k. wobble). Nii saab näiteks seriini tRNA antikoodoniga AGG seonduda nii koodonitele UCU kui ka UCC. Mitmed tRNA molekulid sisaldavad antikoodoni positsioonis, mis paardub koodoni viimases positsioonis oleva nukleotiidiga, lämmastikalust inosiin. Inosiin (nukleotiidse järjestuse esitamisel tähistatakse seda I-ga) on võimeline paarduma nii uratsiili, tsütosiini kui ka adeniiniga. Nii saab alaniini siduv tRNA, millel on antikoodon CGI, paarduda koodonitega GCU, GCC või GCA, mis kõik vastavad alaniinile.

 

Supressormutatsioonid tRNA-s

 

Asendusmutatsioonid valke kodeerivates geenides võivad kodeeriva järjestuse keskele tekitada näiteks translatsiooni stop koodoni. Selliseid mutatsioone nimetatakse nonsens-mutatsioonideks. UAG stop koodoni e. amber koodoni tekitanud mutatsioone kutsutakse ka amber mutatsioonideks. Mutatsioone, mis muudavad koodneid nii, et need need kodeerivad teist aminohapet, nimetatakse missens-mutatsioonideks. Juhul, kui tRNA geenis tekib mutatsioon, mis muudab vastava tRNA antikoodonjärjestust, seondub mutantne tRNA mRNA-l valele koodonile. Selliseid mutatsioone täheldati esmalt geneetilistes katsetes, kus leiti, et üks asendusmutatsioon ühes geenis surub maha e. supresseerib teises geenis tekkinud mutatsiooni avaldumise. Seetõttu hakati neid mutatsioone nimetama supressormutatsioonideks. Kõige tüüpilisemaks supressormutatsiooni näiteks on mutatsioonid tRNA geenides, mille tulemusena mutatsioon tRNA antikoodonis võimaldab tRNA-l paarduda mRNA-s oleva UAG stop koodoniga ja taastada täispika polüpeptiidi sünteesi. Stop koodoniga paarduvat mutantset tRNA-d nimetatakse supressor-tRNA-ks. 

   

<tagasi

14. Mutatsioonid, DNA reparatsioon ja rekombinatsioon

 

Mutatsioonid võimaldavad geneetilist varieeruvust ja on alusmaterjaliks evolutsioonile

 

Geneetiline informatsioon on talletatud DNA nukleotiidses järjestuses. DNA molekuli replikatsiooni täpsus sõltub DNA polümeraasi vigu korrigeerivast (ingl. k. proofreading) aktiivsusest. Sellegipoolest tekib geneetilise materjali kopeerimisel vigu, mida nimetatakse mutatsioonideks. Organismi, kellel avaldub mutatsiooni tagajärjel uus fenotüüp, nimetatakse mutandiks. Muutusi genotüübis põhjustavad ka rekombinatsioonilised sündmused, mis tekitavad olemasolevate geneetiliste variantide baasil uusi kombinatsioone.  Mutatsioonilised muutused, mis suurendavad populatsiooni geneetilist varieeruvust uute variantide tekke kaudu, võib jaotada muutusteks kromosoomide tasemel (muutused kromosoomide arvus ja struktuuris) ning muutusteks geenitasemel, kus enamasti on tegemist muutustega spetsiifilistes muutustega DNA järjestuses. Viimaseid nimetatakse punktmutatsioonideks. Punktmutatsioonid on asendusmutatsioonid, kus üks aluspaar DNA järjestuses asendub teise aluspaariga ning insertsioonid ja deletsioonid ühe või enama nukleotiidi ulatuses. Enamasti kasutatakse terminit “mutatsioon”, mõeldes selle all punktmutatsioone.

 

Mutatsioonid on päritavad muutused geneetilises materjalis, mis võimaldavad organismide populatsioonisisest geneetilist varieeruvust. Rekombinatsiooni tulemusena tekivad olemasolevate variantide (alleelide) uued kombinatsioonid, mis on toormaterjaliks evolutsioonile. Mutatsioonisagedus ei tohi olla ei liiga kõrge ega liiga madal. Kui mutatsioone ei tekiks, peatuks evolutsioon. Kui mutatsioonisagedus oleks liiga kõrge, koormataks populatsioon kiiresti üle kahjulike mutatsioonidega ja isendite arvukus populatsioonis hakkaks vähenema.

 

Mutatsioonide olemus

 

Mutatsioonide  avaldumine

 

Mutatsioone tekib kõigis elusorganismides. Mutatsioonid on kas neutraalsed (sel juhul ei muuda nad fenotüüpi) või on neil fenotüübile kas positiivne või negatiivne efekt. Bakterites, kelle genoom on haploidne, on mutatsioonidel võimalus kohe avalduda. Diploidse organismi puhul on mutatsiooni avaldumise seisukohalt määravaks see, kas tegemist on dominantse või retsessiivse mutatsiooniga. Retsessiivne mutatsioon saab avalduda ainult homosügootses olekus, dominantne avaldub aga koheselt. Hulkraksetes organismides sõltub mutatsioonist põhjustatud fenotüübilise efekti avaldumine ka sellest, millal ja mis tüüpi rakus mutatsioon on tekkinud. Näiteks kõrgemate loomade puhul eristatakse somaatilisi  ja sugurakkudes tekkinud mutatsioone (germinal mutations). Järgmisesse põlvkonda kanduvad edasi ainult viimased. Juhul, kui mutatsioon tekib somaatilises rakus, avaldub mutantne fenotüüp vaid selle raku järglastes. Sugurakus tekkinud mutatsiooni puhul on oluline ka see, millises sugurakkude diferentseerumise staadiumis mutatsioon tekkis. Juhul, kui mutatsioon tekkis juba sugurakkude varajase diferentseerumise staadiumis, moodustub antud mutatsiooniga rohkem gameete ja seetõttu on ka suurem tõenäosus, et mutatsioon pärandub järglastele. Kui aga mutatsioon on tekkinud alles küpses sugurakus, võib see edasi kanduda vaid ühele potentsiaalsele järglasele. Koduloomade puhul on näiteks kirjeldatud päritavat dominantset mutatsiooni, mis põhjustab lambal lühijalgsust. Tõuaretajad on seda mutatsiooni kasutanud paiksemate loomade aretamiseks.

 

Spontaansed ja indutseeritud mutatsioonid

 

Spontaanne mutatsioonisagedus rakus on madal. Bakterites ja bakteriofaagides (bakteriviirustes) tekib spontaanseid mutatsioone sagedusega 10-8 kuni 10-10 nukleotiidipaari kohta generatsioonis, eukarüootse raku puhul aga vahemikus 10-7 kuni 10-9 nukleotiidipaari kohta generatsioonis. Kui arvutada mutatsioonisagedust geeni kohta, võttes keskmise geeni pikkuseks 1000 aluspaari, saame mutatsioonisageduse, mis varieerub vahemikus 10-4 kuni 10-7 generatsiooni kohta.

 

Teatud füüsikalised tegurid nagu näiteks ultraviolettkiirgus ja kemikaalid, mis kahjustavad DNA-d, teisisõnu mutageenid, võivad tõsta mutatsioonisagedust rakus võrreldes spontaanse mutatsioonisagedusega mitu suurusjärku. Mutageenide toimel tekkinud mutatsioone nimetatakse indutseeritud mutatsioonideks.  

 

Mutatsiooniteke on juhuslik protsess

 

Kui lisada bakterikultuurile antibiootikumi, näiteks streptomütsiini, sureb enamus rakke, kuid üksikud rakud populatsioonist moodustavad streptomütsiini sisaldaval söötmel kolooniaid. Bakterigeneetikutele oli pikka aega selgusetu, kas antibiootikumile resistentsed mutandid on eelnevalt bakteripopulatsioonis olemas või indutseerib vastava mutatsiooni teket antibiootikum. Seda, et antibiootikumile resistentsed mutatsioonid tekivad bakteripopulatsioonis spontaanselt ning ei ole antbiootikumi poolt indutseeritud, suudeti tõestada alles 1950-ndate alguses.

 

Joshua ja Esther Lederberg võtsid 1952. a. kasutusele uue meetodi, jäljendkülvi (replica plating), mis võimaldab huvipakkuva tunnuse osas bakteripopulatsioonis korraga läbi testida palju individuaalseid rakke. Kui külvata piisavalt lahjendatud bakterikultuur tardsöötmele, moodustuvad sinna bakterikolooniad (iga bakterikoloonia agarsöötmel on ühe bakteriraku järglaskond). Jäljendkülvi abil on võimalik testida näiteks ka seda, kas bakteripopulatsioonis oli streptomütsiini resistentseid mutante enne bakterite kokkupuutumist streptomütsiiniga. Bakterikultuuri lahjendatakse sellisel määral, et lahjendatud kultuuri viimisel Petri tassil olevale tardsöötmele (agarsöötmele) moodustub ligikaudu paarsada üksikkolooniat. Külve tehakse paljudele Petri tassidele ja nii saadakse testimiseks palju üksikkolooniaid. Kolooniatega tembeldatakse steriilset sametit (kolooniatega Petri tass surutakse vastu sametit, iga koloonia puutub kokku sameti pinnaga ja jätab kokkupuute kohale bakterirakke – jäljendi kolooniast) ja seejärel tembeldatakse sametiga, mis sisaldab jäljendeid kõigist kolooniatest, Petri tassi, kus on selektiivne tardsööde, mis võimaldab kasvada ainult mutantidel. Kui testiti bakterikolooniaid streptomütsiini resistentsuse suhtes, siis andsid streptomütsiini sisaldaval söötmel kasvu ainult vähestest kolooniatest tehtud jäljendid. Need kolooniad algsel tassil, millest tehtud jäljendid andsid kasvu selektiivsöötmel, sisaldasid ka uuesti testimisel streptomütsiini resistentseid rakke. Need kolooniad, millest jäljendkülv kasvu ei andnud, ei sisaldanud ka uuesti testimisel streptomütsiini resistentseid mutane. See katse näitab seda, et streptomütsiini suhtes resistentsed mutandid olid bakteripopulatsioonis olemas juba enne rakkude kokkupuutumist antibiootikumiga. 

 

Mutatsioonide reverteerumine

 

Mutatsiooni, mis muudab algset DNA järjestust, tekitades uue alleeli, nimetatakse „edasiviivaks“ (ingl. k. forward) mutatsiooniks. Algne DNA järjestus võib ka taastuda „tagasiviiva“ mutatsiooni (back mutation) tulemusena. Sellist protsessi, kus sekundaarse mutatsiooni tulemusena taastub algne fenotüüp, nimetatakse reverteerumiseks (reversion) ja mutanti revertandiks. Revertant võib olla tekkinud ka supressormutatsiooni tulemusena. Supressormutatsiooni puhul ei taastu mitte algne DNA järjestus, vaid mutatsioon tekib genoomi teises piirkonnas. See mutatsioon surub aga maha algselt tekkinud mutatsiooni toime. Geneetiliste katsete abil on võimalik kontrollida, kas reverteerumist põhjustas supressormutatsioon või mutatsioon, mis taastas algse DNA järjestuse. Selleks viiakse läbi tagasiristamised, ristates reverteerunud fenotüübiga isendeid (revertante) algse, metsiktüüpi organismiga, kellel pole toimunud esmast mutatsiooni. Juhul, kui on tegemist tagasiviiva muatsiooniga, saadakse kõik järglased metsiktüüpi fenotüübiga. Kui aga osa järglastest on mutantse fenotüübiga, on tegemist supressormutatsiooniga.

 

Mutatsioonide fenotüübiline efekt

 

Mutatsioonid võivad olla kas retsessiivsed või dominantsed. Monoploidsetes organismides nagu bakterid ja viirused on mutatsioonidel võimalus kohe avalduda. Dipoidsetes organismides saavad retsessiivsed mutatsioonid avalduda vaid homosügootses olekus. Erandiks on siin X-liitelised mutatsioonid – mutatsioonid, mis tekivad X kromosoomis, mis sel juhul, kui on tegemist hemisügootse seisundiga (XY genotüüp isastel näiteks inimesel ja äädikakärbsel, lindudel aga emastel), saavad kohe avalduda. See on ka põhjus, miks X-liitelised haigused avalduvad meestel sagedamini kui naistel. Enamus kahjulikke mutatsioone populatsioonis on retsessiivsed, sest dominantseid kahjulikke mutatsioone sisaldavad alleelid kõrvaldatakse loodusliku valiku teel tunduvalt kiiremini.

 

Kõik geeni järjestuses tekkinud mutatsioonid tekitavad selle geeni suhtes uue alleeli. Juhul, kui geenis tekkinud mutatsioon ei põhjusta muutusi fenotüübis või on efekt vaevumärgatav, on tegemist vastava geeni isoalleeliga. Selliseid mutatsioone nimetatakse neutraalseteks mutatsioonideks. Need mutatsioonid võivad näiteks muuta aminohapet kodeeriva koodoni kolmandat nukleotiidi, ilma et muutuks aminohape mutantse alleeli poolt kodeeritud polüpeptiidis. Osade mutatsioonide tagajärjel tekivad nullalleelid, mille tulemusena mutantne geen ei kodeeri enam valku või kodeerib mittefunktsionaalset valku. Juhul, kui muteerunud geen kodeeris varem organismile eluliselt tähtsat valku, siis vastava mutatsiooni sattumine homosügootsesse olekusse on organismile letaalse toimega. Sellised mutatsioonid on retsessiivsed letaalsed.

 

Näiteid mutatsioonidest, mis muudavad valgu omadusi, on palju. Üheks levinuimaks näiteks on mutatsioonid geenis, mis kodeerib inimese hemoglobiini A beeta ahelat. Näiteks T:A aluspaari asendumine A:T aluspaariga muudab ära polüpeptiidi kuuenda aminohappe – glutamiini asemel (mis on negatiivselt laetud) on mutantses valgus valiin (laenguta). Mutatsioon muudab valgu konformatsiooni ja põhjustab hemoglobiini agregeerumist. Selline mutantne alleel HbS põhjustab sirprakset aneemiat (punased vererakud on sirbikujulised). Inimpopulatsioonis on kirjeldatud üle 100 erineva hemoglobiini variandi, kus mutatsiooni tagajärjel on üks aminohape polüpetiidis asendunud teisega. Kui sellega kaasneb ka laengu muutus vastavas positsioonis, võib see mõjutada valgu konformatsiooni. Laengut mitte muutvad asendused ei ole enamasti nii silmatorkava efektiga.

 

Kui mutatsiooni tagajärjel muutub ühe metabolismiraja ensüümi aktiivsus, võib see blokeerida terve metaboolse raja. Näiteks fenüülalaniini ja türosiini metabolismiraja puhul on kirjeldatud viit erinevat päritavat autosomaalset retsessiivset defekti metabolismiraja erinevate etappide osas. Näiteks fenüülketonuuria puhul pole indiviidil mutatsiooni tõttu funktsionaalset fenüülalaniini hüdroksülaasi, mis konverteeriks fenüülalaniini türosiiniks. Vastsündinud, kes on sellise defektiga, tuleb viia fenüülalaniini dieedile. Vastasel juhul jäävad nad hiljem vaimselt alaarenenuks. Teine autosomaalne retsessiivne mutatsioon fenüülalaniini ja türosiini metabolismi rajas, mis on seotud homogentisiinhappe oksüdaasi defektsusega, põhjustab haigust nimega alkaptonuuria. Türosiini katabolismiraja ensüümide defektsusega seostub kaks geneetilist haigust. Türosinoosi puhul on tegemist mutatsiooniga, mille puhul ei sünteesita türosiini transaminaasi ning türosineemia puhul puudub haigetel p-hüdroksüfenüülpüruvaadi oksüdaas. Türosinoosi puhul on haigetel türosiini tase veres ja uriinis kõrge ja on leitud erinevaid väärarenguid. Türosineemia puhul on nii türosiini kui ka p-hüdroksüfenüülpüruvaadi kogus veres ja uriinis üle normi ja vastsündinud surevad kuue kuu jooksul maksakahjustuste tõttu. Türosiini metabolismi defektsusega on seotud ka albinism, mille puhul on blokeeritud türosiinist pigmendi melaniin süntees. Tegemist on jällegi autosomaalse retsessiivse tunnusega. Kuna melaniini sünteesimine türosiinist vajab mitut ensüümreaktsiooni, on kirjeldatud erinevaid albinismi tüüpe, kus mutatsiooni tagajärjel võivad olla defektsed erinevad ensüümid. Seetõttu, kui mõlemad vanemad on albiinod, aga kannavad mutatsiooni erinevates geenides, on nende lapsed normaalselt pigmenteerunud.

 

Letaalsete mutatsioonide uurimine

 

Osa mutatsioone on letaalsed ainult teatud tingimustel (ingl. k. conditional mutations – konditsionaalsed mutatsioonid). Selline omadus võimaldab isoleerida ja elus hoida letaalseid mutatsioone kandvaid organisme tingimustel, kus need mutatsioonid ei avaldu (permissive conditions – permissiivsed tingimused) ja uurida, milliseid elutähtsaid protsesse need mutatsioonid pärsivad teistel tingimustel (restrictive  conditions – piiravad tingimused). Nii on uuritud näiteks organismi arengut mõjutavate geenide funktsioone. Mikroorganismide puhul võib konditsionaalseid letaalseid mutatsioone jaotada kolme erinevasse klassi:

1)       Auksotroofsed mutandid – mutandid, kelle rakkudes ei sünteesita elutegevuseks vajalikku metaboliiti (aminohappe, puriin, pürimidiin, vitamiin). Sellised mutandid on eluvõimelised vaid tingimustel, kus toitainete hulgas on valmis kujul olemas ka limiteeriv metaboliit;

2)       Temperatuuritundlikud mutandid – mutandid on  kaotanud eluvõime teatud temperatuuril. Enamasti on tegemist kuumatundlike mutantidega, kus mutantne ensüüm on kõrgemal temperatuuril (näiteks 42° C) labiilne. Enamasti ilmneb temperatuuritundlikkus mutantse ensüümi sünteesi käigus; valmis sünteesitud ensüümi stabiilsus ei erine metsiktüüpi ensüümi stabiilsusest.

3)       Supressori-tundlikud mutandid – need mutandid on eluvõimelised vaid teatava supressormutatsiooni olemasolu korral. Supressormutatsioon korrigeerib või kompenseerib uuritava mutatsiooni fenotüüpi. Vt. amber mutatsioone, mis surusid maha translatsiooni stop koodoni tekitanud mutatsiooni efekti.

 

Mutatsioonitekke molekulaarsed mehhanismid

 

Vesinikuaatomite asukoht lämmastikalustes ei ole stabiilne, vaid nad võivad liikuda näiteks aminorühmalt puriini või pürimidiinirõnga lämmastikule. Sellised tautomeersed üleminekud võivad mõjutada lämmastikaluste paardumisvõimet ja põhjustada spontaanseid asendusmutatsioone. Tümiin ja guaniin võivad minna keto-vormist vähemstabiilsesse enool-vormi ning adeniin ja tsütosiin aminovormist vähemstabiilsesse iminovormi. Kui mõni lämmastikalusetest on DNA replikatsiooni toimumise hetkel imino- või enoolvormis, võivad replikatsioonil paarduda adeniin ja tsütosiin või guaniin ja tümiin. Juhul, kui valepaari replitseerunud DNA-st ei korrigeerita, kinnistub asendusmutatsioon järgmise replikatsiooni tsükliga. Asendusmutatsioone on kahte tüüpi:

1)       Transitsioonid – puriin-nukleotiid asendub puriin-nukleotiidiga ja pürimidiin-nukleotiid pürimidiin-nukleotiidiga (näiteks tsütosiin-nukleotiid tümiin-nukleotiidiga);

2)       Transversioonid – puriin-nukleotiid asendub pürimidiin-nukleotiidiga ja vastupidi (näit. adeniin-nukleotiid tsütosiin-nukleotiidiga).

 

Ühe või kahe spontaansel lisandumisel DNA ahelasse või deleteerumisel DNA-st on tegemist raaminihke mutatsioonidega. Juhul, kui selline mutatsioon tekib valku kodeerivas geenis, nihkub nukleotiidse järjestuse lugemisraam. Näiteks ühenukleotiidse deletsiooni tõttu loetakse nukleotiidide tripleteid alates mutatsiooni kohast ühe nukleotiidi võrra nihkes ja selle tulemusena sünteesitakse translatsioonil hoopis teistsuguse aminohappelise järjestusega polüpeptiid, mis on kaotanud oma algse funktsiooni. Kolmenukleotiidse deletsiooni või insertsiooni tagajärjel jääb alles algne lugemisraam, küll on aga sünteesitud polüpeptiid vastavalt kas ühe aminohappe võrra lühem või pikem. 

 

Spontaansete mutatsioonide tekkesagedust mõjutavad:

1)       DNA replikatsiooni täpsus;

2)       DNA reparatsiooni efektiivsus;

3)       Mutageensete faktorite olemasolu ja hulk keskkonnas.

 

Kemikaalide poolt indutseeritud mutagenees

 

1927. a. näitas H. J. Muller, et röntgenkiirgus indutseerib äädikakärbsel suguliitelisi retsessiivseid letaalseid mutatsioone. Lisaks kiirgusele tõstavad mutatsioonisagedust rakus ka mitmesugused DNA-d kahjustavad ja modifitseerivad kemikaalid. Näiteks sinepigaas, mida kasutati II Maailmasõjas keemiarelvana, on mutageen. Sinepigaasi mutageense toime avastas Charlotte Auerbach’i uurimisrühm, kuid nende tulemusi ei avaldatud enne kui sõja lõppedes. Nii sinepigaas kui ka teised keemilised mutageenid kannavad DNA-s asuvatele lämmastikalustele alküülrühmi. Seetõttu nimetatakse selle grupi mutageene alküleerivateks ühenditeks. 

 

Keemilisi mutageene saab klassifitseerida ka selle alusel, kas nad on mutageense toimega nii replitseeruvale kui ka mittereplitseeruvale DNA-le (alküleerivad ühendid ja lämmastikushape) või nad on mutageenid ainult replitseeruvale DNA-le (lämmastikaluste analoogid, mis lülituvad sünteesitavasse DNA ahelasse; akridiinvärvid, mis interkaleeruvad DNA-sse, muutes selle struktuuri, nii et see võib soodustada vigade teket DNA replikatsioonil).

 

Lämmastikaluste analoogid

 

Mutageensed lämmastikaluste analoogid on struktuurilt sarnased normaalsete lämmastikalustega, kuid piisavalt erinevad, et põhjustada valepaardumisi DNA ahelate vahel. Kaks kõige tuntumat lämmastikaluste analoogi on 5-broomuratsiil ja 2-aminopuriin. 5-broomuratsiil on tümiini analoog, mis võib keto-vormist kergesti minna enool-vormi ja paarduda adeniini asemel guaniiniga, põhjustades transitsioon-mutatsioone. Võimalikud on nii G:C ®  A:T transitsioon (kus nukleosiidtrifosfaat, mille koostises 5-broomuratsiil on enoolvormis, lülitub replikatsiooni käigus guaniini sisaldava nukleotiidi vastu) kui ka A:T  ® G:C transitsioon, kus DNA ahelasse on 5-broomuratsiili keto-vormis sisaldav nukleotiid lülitunud korrektselt adeniini vastu, aga kui järgmise replikatsiooni tsükli ajal on 5-broomuratsiil läinud enoolvormi, võib tema vastu lülituda guaniinnukleotiid. Seega indutseerib 5-broomuratsiil transitsioone mõlemasuunaliselt ja võib põhjustada ka algse mutatsiooni tagasi reverteerumist. 2-aminopüriin toimib sarnase mehhanismi alusel, lülitudes DNA-sse nii adeniin- kui ka guaniin-nukleotiidi asemel.

 

Lämmastikushape (HNO3)

 

Lämmastikushape on potentsiaalne mutageen nii replitseeruvale kui ka mittereplitseeruvale DNA-le. See kemikaal põhjustab kõigi nelja nukleotiidi puhul lämmastikaluste oksüdatiivset deamiinimist, konverteerides amino-rühma keto-rühmaks. Selle tulemusena võib muutuda lämmastikaluse paardumisspetsiifika. Näiteks adeniinist tekib hüpoksantiin, mis paardub tümiini asemel tsütosiiniga. Tsütosiin konverteeritakse uratsiiliks ja see paardub guaniini asemel adeniiniga. Guaniini deamineerimisel moodustub ksantiin, kuid ksantiin, nii nagu guaniingi, paardub tsütosiiniga. Kuna adeniini deamineerimine põhjustab A:T  ® G:C transitsioone ning tsütosiini deamineerimine G:C® A:T transitsioone, indutseerib lämmastikushape transitsioone mõlemas suunas. Seega võivad lämmastikushappe poolt indutseeritud mutatsioonid lämmastikushappe toimel ka tagasi reverteeruda.

 

Akridiinvärvid

 

Akridiinvärvide rühma kuuluvad proflaviin, akridiinaornz jt. Mutageenid, mis ladestuvad DNA molekulis aluspaaride vahele, muutes sellega DNA konformatsiooni. Konformatsiooni muutused võivad omakorda indutseerida raaminihke mutatsioonide teket.

 

Alküleerivad ühendid

 

Alküleerivad ühendid, nii nagu juba nende nimetus vihjab, loovutavad teistele molekulidele alküülrühma. Siia gruppi kuuluvad sinepigaas, metaan sulfonaat (MMS), etaan sulfonaat (EMS). Alküleerivad ühendid indutseerivad erinevaid mutatsioonitüüpe – transitsioone, transversioone, raaminihkeid ning isegi kromosoomide katkeid. Näiteks EMS etüleerib guaniini: 7-etüülguaniin on võimeline paarduma tümiiniga, nii et sel juhul on tegemist G:C® A:T transitsiooniga. Samas enamus alküleerivaid ühendeid atakeerivad DNA-d mittespetsiifiliselt.

 

Hüdroksüleerivad ühendid

 

Hüdroksüülamiinil on spetsiifiline mutageenne efekt: ta hüdroksüleerib tsütosiini amino-rühma, mille tagajärjel tekkiv hüdroksüülaminitsütosiin paardub adeniiniga, põhjustades samuti G:C® A:T transitsioone.

 

Kiirgusega indutseeritavad mutatsioonid

 

Eristatakse ioniseerivat kiirgust (röntgenkiired, gamma kiirgus, kosmiline kiirgus), mis on tugeva energiaga, läbistades elusorganismide kudesid kauge vahemaa tagant ja mitteioniseerivat kiirgust (ultraviolettkiired), mis on madalama energiaga ja jõuavad vaid kudede pindmiste rakkudeni. Mõlema kiirguse toimel on aatomid molekulides reaktiivsemad, põhjustades seetõttu mutatsioone DNA-s. Mida suurem on kiirguse doos, seda enam tõstab see mutatsioonisagedust. Lisaks punktmutatsioonidele indutserib ioniseeriv kiirgus ka ulatuslikke ümberkorraldusi kromosoomides. UV kiirguse toimel moodustuvad pürimidiinide (tümiin ja tsütosiin) hüdraadid ja dimeerid. Tümiini dimeerid põhjustavad mutatsioone kahel viisil: nad muudavad DNA heeliksi struktuuri, vähendades selle läbi DNA replikatsiooni täpsust ning nende teke stimuleerib mutageenset DNA sünteesi. DNA-le on kõige tugevama mutageense toimega 254 nm UV-kiirgus.

 

 

Transponeeruvate elementide poolt indutseeritud mutatsioonid

 

Transponeeruvad elemendid võivad liikuda genoomis ringi. Kui transponeeruv element inserteerub (siseneb) funktsionaalse geeni sisse, inaktiveerib ta selle geeni. Paljud klassikalistest mutatsioonidest, mida on kirjeldatud näiteks äädikakärbse puhul, on põhjustatud transponeeruvate elementide poolt. Näiteks äädikakärbse mutatsioon white, mis põhjustab valgesilmsust ning kortsus pinnaga (wrinkled) herneterad, tunnus, mida Mendel kasutas alleelide pärandumisseaduspärasuste uurimisel, on tekkinud metsiktüüpi alleelist transponeeruva elemendi insertsiooni tulemusena.  

 

Ames’i test kemikaalide mutageensuse uurimiseks

 

Mutageenid on sageli ka kartsinogeennse toimega. See tähendab, et nad indutseerivad vähi teket. Vähirakkudele on iseloomulik kontrollimatu paljunemisvõime. Rakkude jagunemist kontrollib terve rida geene (onkogeenid ja tuumori supressorgeenid). Kui mõnes neist geenidest on tekkinud mutatsioon, kaob raku jagunemise kontroll ja võib areneda kasvaja. Kuna kaasaegne tööstus toodab järjest uusi kemikaale, on vaja eelnevalt, kui lubada neid masstootmisesse, testida nende mutageenset ja kartsinogeenset toimet. Algselt testiti uusi kemikaale vastsündinud hiirtel, viies nende organismi kemikaale toiduga või süstides. Kuna mutatsioonisagedus on madal, on usaldusväärsete andmete saamiseks vaja uurida suurt hiirte populatsiooni. Seega on sellised testid vähetundlikud, aeglased ja kallid.

 

Bruce Ames ja kolleegid töötasid välja kiire, odava ja väga tundliku meetodi kemikaalide mutageensuse testimiseks. See meetod põhineb bakterite histidiini suhtes auksotroofsete mutantide reverteerumissageduste mõõtmisel tingimustes, kus bakterite kasvukeskkonda on lisatud uuritavaid kemikaale. Mida mutageensem on kemikaal, seda suuremal hulgal tekib bakteripopulatsiooni revertante (bakterirakke, kes on võimelised kolooniaid moodustama histidiini-vabas keskkonnas). Salmonella typhimuriumi puhul on genereeritud terve rida erinevaid histidiini suhtes auksotroofseid mutante, mis kannavad kas transitsioone, transversioone või raaminihke-mutatsioone. Kuna paljud kemikaalid on mutageensed vaid replitseeruva DNA korral, lisatakse bakterite kasvukeskkonda vähesel määral ka histidiini, et rakud saaksid mõned korrad jaguneda, samas aga mitte piisavalt vähe, et ei moodustuks söötmel nähtavaid kolooniaid. Nii testiti läbi tuhandeid erinevaid kemikaale.

 

Osade potentsiaalselt kartsinogeensete kemikaalide puhul mutatsioonisagedus bakterirakus ei tõusnud. Põhjuseks oli see, et need kemikaalid muutuvad mutageenseks alles eukarüoodi rakus toimuvate biokeemiliste protsesside tagajärjel. Selleks, et tekitada algsetest kemikaalidest metaboliite, mis võiksid olla potentsiaalsed mutageenid, töödeldakse uuritavaid kemikaale enne bakterikultuurile lisamist roti maksa ekstraktiga. Näiteks nitraadid, mida kasutatakse lihas säilitusainetena, ei ole ise mutageensed ega ka kartsinogeensed. Samas konverteeritakse eukarüootsetes rakkudes nitraadid nitrosamiinideks, mis on väga tugevad mutageenid ja kartsinogeenid. Ames’i testi tulemusena selgus ka, et mitmed sigareti suitsus olevad komponendid võivad stimuleerida raaminihke mutatsioonide teket.

 

DNA reparatsioonimehhanismid

 

Kõigil elusorganismidel on selleks, et ära hoida liiga kõrget mutatsioonisagedust, mitmeid erinevaid DNA reparatsioonisüsteeme. Bakteri E. coli puhul on põhilisteks reparatsioonisüsteemideks valgusest sõltuv fotoreaktivatsioon, väljalõikereparatsioon (excision repair), replikatsioonijärgne valepaardumisi kõrvaldav DNA “mismatch” reparatsioon MMR (mismatch repair) ja rekombinatsiooniline reparatsioon. Sarnased reparatsioonisüsteemid (v.a. fotoreaktivatsioon) on välja kujunenud ka imetajatel. Inimese puhul on leitud, et osa vähivorme on seotud DNA reparatsiooni defektsusega.

 

Fotoreaktivatsioon

 

Fotoreaktivatsioonil osaleb valgustundlik ensüüm fotolüaas. Kui kiiritada DNA-d ultraviolettkiirgusega, võivad DNA-s moodustuda omavahel kovalentselt seotud tümiini dimeerid. Fotolüaas seondub spetsiifiliselt tümidiini dimeeridele ning lõhub valgusenergiat kasutades tümiinide vahelise sideme. Fotolüaas on võimeline tümiini dimeeridele seonduma ka siis, kui hoida bakterirakke pimedas, kuid sel juhul ei katalüüsi ta sideme katkestamist. Photolüaas lahutab ka tsütosiini ning tsütosiini ja tümiini dimeere. Seega selleks, et indutseerida ultraviolettkiirgusega bakterirakkudes mutatsioone, tuleb bakterirakke kõrgema mutatsioonisageduse saamiseks hoida pimedas.

 

 

Väljalõikereparatsioon

 

Väljalõikereparatsiooni puhul võib olla tegemist kas kahjustatud lämmastikaluste väljalõikamisega (base excision repair) või nukleotiidide väljalõikamisega (nucleotide excision repair).

 

Lämmastikaluste väljalõikamine

 

Kahjustatud lämmastikaluste kõrvaldamisel DNA-st osalevad N-glükosülaasid. Selle tulemusena tekib DNA ahelas AP sait (abasic site), mida atakeerib AP endonukleaas, lõhkudes fosfodiestersideme. Seejärel kõrvaldab desoksüriboosi DNA ahelast AP endonukleaas. Osadel glükosülaasidel on olemas ka AP endonukleaasne aktiivsus.

 

Uratsiil DNA glükosülaas (ung geeni produkt) on väga spetsiifiline ja kõrvaldab DNA ahelast ainult uratsiili. Uratsiil tekib tsütosiini deamineerimise tulemusena. Sellel ensüümil AP endonukleaasne aktiivsus puudub.

 

Guaniini oksüdatsiooniprodukt on 8-hüdroksüguaniin (GO). GO kahjustusi põhjustavad hapniku radikaalid tekivad rakus ka tavaliste protsesside (elektronide transport, lipiidide peroksüdatsioon) tulemusena. Seetõttu on GO reparatsioon üks olulisemaid vigade ärahoidmise ja korrigeerimise süsteeme. Replikatsioonil viib DNA polümeraas GO võrdse efektiivsusega nii C kui A vastu (3% efektiivsusest, millega ta õiget nukleotiidi inkorporeerib). GO valepaardumisest põhjustatud asendusmutatsioonide vältimiseks on E. coli’s olemas 3 valku – MutM, MutT ja MutY. MutT on ennetava funktsiooniga – ta lagundab rakkudes GO-d. MutM ja MutY on glükosülaasid. MutM kõrvaldab DNA ahelast GO. MutY kõrvaldab valesti paardunud A nii A/G kui A/GO puhul. GO reparatsiooniensüümide homolooge on leitud ka eukarüootsetest rakkudest.

 

Nukleotiidide DNA ahelast väljalõikamine

 

Bakterites on kirjeldatud kaks reparatsioonirada:

1)       Pikk reparatsioonirada - kõrvaldatakse 1500 nt, osaleb DNA pol I.

2)       Lühike reparatsioonirada - kõrvaldatakse 12 nt, osalevad UvrABC ekstsinukleaas (excinuclease, väljalõikenukleaas) ja UvrD.

 

UvrA (kahjustust tundev valk) ning UvrB (helikaas) tunnevad DNA-d skanneerides ära defekti. Kahjustuse kohal toimuvad konformatsioonilised muutused, mille tagajärjel UvrA dissotseerub ning UvrB ja defektse ala kompleksiga seostub UvrC. UvrB-l on endonukleaasne aktiivsus, ta tekitab katke 5-ndasse fosfodiestersidemesse kahjustusest 3´-suunas. 8-nda fosfodiestersideme katke kahjustusest 5´-suunas teostatakse UvrC poolt. Seejärel kõrvaldab UvrD helikaas (DNA helikaas II) üksikahelalise 12 nt-pikuse DNA lõigu ja DNA polümeraas I sünteesib tühiku täis.

 

Sarnane reparatsioonisüsteem ja valgud on olemas ka inimesel, kuid võrreldes bakteriaalse reparatsioonisüsteemiga on see tunduvalt komplekssem, koosnedes 17-st polüpeptiidist. DNA-st kõrvaldatakse 29 nt-pikkune oligomeer. Mutatsioonid väljalõikenukleaasi kodeerivates geenides põhjustavad ülitundlikust päkesekiirgusele. Vastavat haigust xeroderma pigmentosum põdevatel inimestel on väga tugev eelsoodumus nahavähiks.

 

DNA “mismatch” reparatsioon MMR

 

Üldiselt on DNA ahelad rakus metüleeritud. Bakterirakus toimub DNA metülatsioon GATC saitidest Dam-metülaasi toimel. Vahetult peale DNA replikatsiooni on uus DNA ahel veel metüleerimata. DNA “mismatch” reparatsioon MMR korrigeerib DNA järjestust replikatsioonijärgselt, kõrvaldades valestipaardunud nukleotiide sellest DNA ahelast, mida pole jõutud veel metüleerida.

 

MutS seondub otseselt DNA kaksikahela mittepaarduva alaga, seejärel liitub MutL. MutS-MutL-DNA kompleks translokeerub hemimetüleeritud GATC saidiga seondunud endonukleaasi MutH juurde, stimuleerides MutH endonukleaasset aktiivsust. MutH lõikab fosfodiestersidet ajutiselt metüleerimata DNA ahelast. MutH poolne lõige võib toimuda kahjustusest kas 5´- või 3´-suunas, mis võib olla kahjustatud kohast kuni 1000 nt kaugusel. Seejärel toimub valestipaardunud nukleotiidi sisaldava regiooni kõrvaldamine eksonukleaaside toimel. DNA ahelate lahtikeeramisel osaleb helikaas UvrD. ssDNA-le sünteesib komplementaarse DNA ahela DNA polümeraas III kompleks. MutS ja MutL homolooge on leitud ka eukarüootsetes rakkudes. MutS homoloogide defektsus võib neis rakkudes põhjustada vähi teket (näit. soolevähki).

 

Rekombinatsiooniline DNA reparatsioon

 

Rekombinatsiooniline DNA reparatsioon on RecA valgust sõltuv ning käivitub rakus SOS vastuse tulemusena (sellest tuleb täpsemalt juttu allpool). DNA replikatsioonikahvel peatub, kui DNA ahelas on kas DNA kahjustus, üksikahelaline või kaksikahelaline katke. RecA valk aktiveerub kokkupuutes ssDNA-ga ning viib kontakti rekombineeruvad DNA molekulid. RecA soodustab DNA ahelate ülekannet, aitab neil paarduda ning osaleb DNA ahelate hargnemiskoha migratsioonil. RecA homolooge on leitud ka eukarüootides. Näiteks Rad51 defektsus põhjustab hiire embrüol letaalset fenotüüpi ning kõrgenenud tundlikkust ioniseeriva kiirguse suhtes. Rad51-ga interakteeruvad mitmed kartsinogeneesis osalevad valgud nagu näiteks BRCA1, BRCA2 ning p53. Pärmis kirjeldatud RecA homoloogil Dmc1 on samuti oluline roll DNA rekombinatsioonil.

 

SOS vastus

 

DNA kahjustuste või DNA replikatsiooni inhibeerimise tagajärjel tekib rakkudes SOS vastus. Induktoriteks  on UV-kiirgus, alküleerivad ühendid, tümiini vaegus ja ravimid. DNA replikatsiooni blokeerimine kahjustuste kohas toob esile ssDNA, kuna DNA polümeraasi III peatumisel jätkab DNA helikaas DnaB DNA ahelate lahtikeeramist. ssDNA aktiveerib RecA valgu, moodustub nukleoproteiinne filament. SOS vastusena käivitub DNA reparatsioon (rekombinatsiooniline reparatsioon) ja SOS mutagenees. Bakteris E. coli põhjustab SOS mutageneesi vigaderohke DNA polümeraas V, mis jätkab kahjustuse kohal peatunud DNA polümeraasi III asemel vigaderohket DNA sünteesi.

 

DNA rekombinatsioonimehhanismid

 

Enamasti kaasneb DNA rekombinatsiooniga ka DNA reparatsiooniline süntees. Rekombinatsioonimehhanisme on uuritud näiteks homoloogiliste kromosoomide vahelise ristsiirde (crossing over) toimumisel.

 

Nagu juba eespool mainitud, on RecA homolooge kirjeldatud ka teistes organismides. Inimesel on selleks valk Rad51. Homoloogiliste kromosoomide vahelise ristsiirde toimumist on kirjeldatud Holliday mudeli abil. Selle mehhanismi alusel tekivad esmalt üksikahelalised DNA katked mõlemal homoloogilisel kromosoomil. Seejärel toimub ssDNA ahelate eraldumine algsest DNA molekulist ja ühest kromosoomist eraldunud ahela ülekanne temaga  homoloogilise kromosoomi komplementaarsele ahelale. Toimub üksikahelate assimilatsioon, mille käigus ühest homoloogilisest kromosoomist pärit üksikahel vahetab välja talle homoloogilise ahela teises homoloogilises kromosoomis. Imetajarakus stimuleerib seda protsessi valk Rad51. Asukohta vahetanud DNA ahelate otsad seotakse katke kohas kovalentselt homoloogilise kromosoomi DNA-ga. Kahe homoloogilise kromosoomi baasil moodustub X-kujuline struktuur, kus homoloogilised kromosoomid on teineteisega ühendatud üksikahelaliste sildade kaudu, mis on teineteisega risti. Selline struktuur võib pöörduda (roteeruda) 180° ümber oma telje. Kui nüüd endonukleaas lahutab kromosoomid teineteisest, võidakse üksikahelalised sillad läbi lõigata kas horisontaalselt või vertikaalselt. Selle tulemusena võivad kõrvuti sattuda erinevatest kromosoomidest pärinevad järjestused. Näiteks kui enne külgnesid ühes homoloogis alleelid A ja B ning teises kromosoomis a ja b, siis ahelate vahetuse ja kromosoomide roteerumise järgselt on teineteisest endonukleaasi toimel lahutatud kromosoomides ühes kromosoomis sattunud kõrvuti alleelid a ja B ning teises A ja b.

 

Rekombinatsioonimehhanisme on erinevaid. Nii on Szostak ja Stahl ristsiirde mehhanismi kirjeldamiseks välja pakkunud kaksikahelalise katke mudeli. Sel juhul on homoloogilised kromosoomid rekombinatsioonikohas teineteisega ühendatud üksikahelaliste sildade kaudu kahest kohast. Sellist mehhanismi on kirjeldatud näiteks pärmis.

 

Geeni konversioon

 

Rekombinatsioon homoloogiliste kromosoomide vahel ei pruugi alati olla võrdväärne, retsiprookne, kus homoloogiliste kromosoomide alleelid vahetuvad. Juhul, kui geneetilised markerid (alleelid) on omavahel väga tugevalt aheldunud ja nad paiknevad ristsiirde koha vahetus läheduses, võib ristsiirde produktide lahutamisel alleelide suhe olla muutunud sel viisil, et üks alleelidest on konverteerunud teiseks. Tütarkromatiidide lahknemisel ei ole alleelide suhe mitte 2:2 vaid näiteks 3:1. Seda põhjustab rekombinatsiooni käigus toimuv reparatsiooniline DNA süntees. Ristsiirdel toimuva DNA ahelate ülekande käigus moodustub heterodupleks (omavahel on paardunud erinevate alleelide DNA ahelad), kus väikeste erinevuste tõttu alleelide nukleotiidses järjestuses esineb mittepaardunud alasid. Selliseid kohti võib parandada väljalõike reparatsioon: heterodupleksis kõrvaldatakse lõik ühest alleeli järjestusest, väljalõike tulemusena tekkinud üksikahelalisele alale sünteesitakse talle komplementaarne DNA ahel, lähtudes teise alleeli nukleotiidsest järjestusest. Nii lähebki üks alleelijärjestus kaotsi. 

 

<tagasi

 

15. Geeni kontseptsioon

 

Geeni kontseptsiooni arengust

 

Geeni mõiste on läbi aegade muutunud.

 

Mendeli pärandumisseadused

 

Mendel ei kasutanud tunnuste pärandumisseadusi selgitades terminit “geen”. Mendeli järgi kontrollisid spetsiifilisi fenotüübilisi tunnuseid nagu näiteks õite värvus “tunnusmärgid” (characters) ja “üksust määravad tegurid” (unit factors) – lihtsam oleks siin edaspidi jääda kasutama terminit “faktor“. Mendeli järgi peitus iga tunnuse taga üks faktor. See definitsioon osutus ebatäpseks juba seetõttu, et paljud fenotüübilised tunnused on tegelikult komplekssed, nad on avalduvad paljude erinevate geenide koosmõju tulemusena.

 

Garrod: üks mutantne geen – üks metaboolne blokk

 

Kui 20-nda sajandi algul taasavastati Mendeli tööd, võeti kasutusele ka termin “geen”. Inglise arst Garrod uuris inimestel mitmeid päritavaid haigusi, ning tema oli ka esimene, kes täheldas, et retsessiivsete mutantsete alleelide sattumine homosügootsesse olekusse põhjustab metaboolseid defekte. Sellest tulenevalt tõi ta välja seaduspärasuse: üks mutantne geen – üks metaboolne blokk. Üks haigustest, mida Garrod uuris, oli alkaptonuuria. Alkaptonuuria puhul värvub haigete uriin õhuga kokkupuutel mustaks. Musta värvuse andjaks on uriini kogunenud homogentisiinhape (alkaptoon) ning Garrod arvas, et selle aine kogunemist haigete organismi põhjustab metaboolne blokk homogentisiini metabolismirajas. Hiljem selgus, et metaboolne blokk oli tingitud homogentisiinhappe oksüdaasi puudumisest haigetel. Alkatonuuria oli esimene haigus, mille puhul ilmnes, et seda põhjustab retsessiivne mutatsioon ühes geenis.

 

Beadle ja Tatum: üks geen – üks ensüüm

 

Ligi 40 aastat hiljem arendasid Beadle ja Tatum geeni kontseptsiooni edasi: üks geen – üks ensüüm. Beadle ja Efrussi olid uurinud mutatsioone, mis põhjustasid muutusi äädikakärbse silma värvuses ja järeldasid, et pigmenti tagavad ensüümid võiksid olla geneetiliselt determineeritud. Nendest tulemustest inspireeritult katsetasid Beadle ja Tatum hallitusseenega Neurospora grassa. See seen oli võimeline kasvama minimalsöötmel, mis sisaldas ainult anorgaanilisi sooli, ühte süsinikuallikat ja biotiini, kuna suutis sünteesida kõiki kasvuks vajalikke komponente (aminohappeid, puriine, pürimidiine ja vittamiine peale biotiini). Juhul, kui biosünteesirajad nende komponentide sünteesiks on geneetiliselt kontrollitud, peaksid mutatsioonid geenides võimaldama isoleerida auksotroofseid mutante, kes vajavad kasvukeskkonda neid komponente, mida nad ise pole mutatsiooni tõttu suutelised sünteesima. Teadlased kiiritasid seene spoore röntgenkiirtega ja UV-kiirgusega, mis põhjustavad mutatsioone ja saidki mutante, kes vajasid kasvukeskkonda teatud komponenti (kas mõnda aminohapet, vitamiini või nukleotiidi). Kombineerides geneetilist analüüsi biokeemiliste uuringutega ilmnes, et paljudel juhtudel seostus uuritav mutatsioon teatava ensüümi inaktiivsusega. 1958. aastal said Beadle ja Tatum seose “üks geen – üks ensüüm” väljaselgitamise eest Nobeli preemia. Hiljem muutus see kontseptsioon molekulaargeneetika keskseks seisukohaks.

 

Üks geen – üks polüpeptiid  

 

Üsna varsti selgus, et paljud ensüümid koosnevad mitmetest erinevatest polüpeptiididest. Selle tulemusena täpsustati geeni definitsiooni, mis põhineb seosel “üks geen – üks polüpeptiid”. Näiteks E. coli trüptofaani süntetaas on heteromultimeerne ensüüm, mis koosneb erinevate geenide trpA ja trpB poolt kodeeritud polüpeptiidahelatest ning eukarüootne RNA polümeraas II koosneb paljudest erinevatest polüpeptiididest.

 

Kui palju on ühel organismil erinevaid geene? Pagaripärmil leiti neid 6000 ringis, äädikakärbsel 13000, ümarussil C. elegans 19000 ning taimel Arabidopsis thaliana 26000. Enne inimese genoomi nukleotiidse järjestuse määramist arvati, et inimesel on vähemalt 70000 kuni 100000 geeni. Selgus aga, et neid on vaid 30000 ringis.

 

Geeni struktuuri kirjeldamine

 

Kuni 1940-ndate aastateni käsitleti geeni kui jagamatut üksust: rekombinatsioon toimub geenide vahel, kuid mitte geenide siseselt. Samuti peeti geeni kõige väiksemaks üksuseks, kus saab tekkida mutatsioon. Hiljem leiti, et geneetilise materjali kõige väiksem üksus, mida ei saa enam mutatsioonide ega rekombinatsiooni teel väiksemateks alaosadeks jaotada, on nukleotiidipaar geenis. 1940-ndal aastal avaldas Oliver tulemused katsetest äädikakärbse mutantidega, kus geneetiliste katsete kaudu näidati, et kaks erinevat mutatsiooni olid tekkinud sama geeni erinevatesse asukohtadesse, mistõttu neid tähistati kahe erineva alleelina. Erinevaid mutantseid alleele lzs ja lzg kandvad isendid olid ühesuguse fenotüübiga ning kui korraga mõlemat alleeli lzs ja lzg kandvaid isendeid ristati kas ainult aalleli lzs või lzg kandvate isenditega, saadi 0.2% metsiktüüpi järglasi. Geneetiliste katsete abil välistati, et need kaks uuritavat mutatsiooni võiksid paikneda erinevates lookustes (geenides).

 

Geeni peenstruktuuri mõistmisele aitasid kaasa ka katsed bakteriofaagide mutantidega, kus kaardistati mutatsioonide asukohti geenis. Just nendest katsetest selgus, et rekombinatsioon võib toimuda ka kõrvutiasuvate nukleotiidide vahel. Benzer viis läbi katseid bakteriofaagiga T4 ning identifitseeris erinevaid mutantseid faage ristates ja saadud rekombinante analüüsides T4 geenis rIIA 199 erinevat  mutatsiooni. Rekombinatsiooni kahe külgneva nukleotiidi vahel näidati esmalt Yanofsky töödes, kus oli uuritud E. coli trüptofaani süntetaasi a-polüpeptiidi kodeeriva geeni trpA mutatsioone. Erinevaid mutante iseloomustati valgu aminohappelise järjestuse kaudu. Kõigepealt kaardistati mutatsioonide asukoht geneetiliste katsete abil, kus ristati erinevaid mutante ja identifitseeriti üksteisele kõige lähemal paiknevad mutatsioonid, mille puhul oli võimalik veel rekombinatsiooni abil metsiktüüpi järglasi saada. Nende mutantide puhul määrati ka mutantsete polüpeptiidide aminohappeline järjestus. Yanofsky ja kaastöötajad leidsid, et rekombinatsioon toimus ka selliste mutantide puhul, mille valgu aminohappelises järjestuses oli sama positsiooni aminohape asendunud erinevate aminohapetega: näiteks polüpeptiidi 211-s aminohape glütsiin oli asendunud ühes mutandis arginiiniga ja teise glutamiinhappega. Glütsiini koodonis GGA olid tekkinud  asendusmutatsioonid koodoni esimeses ja teises positsioonis: mõlemal juhul G:C ® A:T transitsioonid), mis tekitasid koodonid AGA (arginiin) ja GAA (glutamiinhape).

 

Geenide ja polüpeptiidide kolineaarsus    

 

1960-ndatel aastatel demonstreerisid Yanofsky ja Brenner kollegidega, et nukleotiidne järjestus geenis on vastavuses aminohapete järjestusega polüpeptiidis. Teisisõnu, geen ja tema poolt kodeeritud polüpeptiid on kolineaarsed: esimesed kolm aluspaari geeni kodeerivas järjestuses määravad ära polüpeptiidi esimese aminohappe, järgmised kolm teise aminohappe jne., kuni geeni kodeeriva järjestuse lõpuni. Kolineaarsust aitasid välja selgitada Yanofsky katsed E. coli trpA mutantidega. Mutantide iseloomustamisest selgus, et mutatsiooni asukoht geenis korreleerus muutunud aminohappe asukohaga polüpeptiidis. Kolineaarsusele viitasid ka Brenneri katsed bakteriofaagi mutantidega. Brenner koos kolleegidega uuris seost polüpeptiidi pikkuse ja stop koodoni asukoha vahel geenis. Kinnitavad tulemused geenide ja polüpeptiidide kolineaarsuse kohta saadi siis, kui töötati välja meetodid, mis võimaldasid määrata geenide nukleotiidset järjestust. Esimene geeni nukleotiidne järjestus määrati bakteriofaagi MS2 kattevalgu puhul Fiers’i ja tema kolleegide poolt. MS2 on RNA faag – tema genoomiks on RNA molekul, mis kodeerib nelja erinevat polüpeptiidi. Kui võrreldi kattevalgu aminohappelist järjestust seda valku kodeeriva RNA nukleotiidse järjestusega, kinnitas see täielikult kolineaarsuse printsiipi.   

 

Geeni geneetiline definitsioon

 

Selleks, et testida, kas erinevad mutatsioonid paiknevad samas või erinevates geenides, rakendatakse komplementatsiooni teste. Kui kaks mutatsiooni asuvad samas kromosoomis, on nad cis-konfiguratsioonis (cis-asendis). Vastavat heterosügooti, kellel on ühes kromosoomis kaks mutatsiooni ja sellele homoloogilises kromosoomis metsiktüüpi DNA järjestused, nimetatakse cis-heterosügoodiks. Juhul, kui kaks uuritavat mutatsiooni asuvad üks ühes ja teine teises homoloogilistest kromosoomidest, on nad trans-konfiguratsioonis ning vastavat heterosügooti nimetatakse trans-heterosügoodiks.

 

Selleks, et selgitada, kas kaks mutatsiooni, mis põhjustavad sarnast fenotüüpi, asuvad ühes või erinevates geenides, kasutatakse trans komplementatsiooniteste. Selline test töötab ainult retsessiivsete mutatsioonide testimisel. Juhul, kui mutatsioonid asuvad erinevates geenides, on nii cis-heterosügoodid kui ka trans-heterosügoodid metsiktüüpi fenotüübiga. Mutatsioonide paiknemisel erinevates geenides komplementeeritakse trans-heterosügootidel ühes kromosoomis asuv geeni mutantne variant teises kromosoomis asuva funktsionaalse geeniga, sest funktsionaalse geeni olemasolu rakus võimaldab sünteesida metsiktüüpi tunnuse avaldumiseks vajalikku valku (näiteks polüpeptiidi, mida on vaja äädikakärbse silma pigmendiks). Kahe mutatsiooni paiknemisel samas geenis on aga ainult cis-heterosügoodid metsiktüüpi fenotüübiga, trans-heterosügoodid seevastu mutantse fenotüübiga, sest neil on mõlemas kromosoomis geenis mutatsioon ja seetõttu ei sünteesita rakus ka vajalikku valku.

 

Viiruste puhul saadakse trans-heterosügoote sel viisil, et nakatatakse viiruse peremeesrakku samaaegselt kahe, erinevat mutatsiooni kandva viirusega. Diploidsete organismide puhul (näiteks äädikakärbes) saadakse trans-heterosügoote sel viisil, et ristatakse omavahel isendeid, kellest üks on homosügootne ühe ja teine teise mutatsiooni osas. Nii näiteks on uuritud äädikakärbse silmavärvust mõjutavate mutatsioonide paiknemist X-kromosoomis. Näiteks mutatsioonid  apr ja w, mis nagu hiljem selgus, paiknevad ühes geenis, on retsessiivsed mutatsioonid, mis homosügootses olekus põhjustavad äädikakärbsel vastavalt kas aprikoosi värvi silmi või pigmendi täielikku puudumist (valged silmad). Vastavad mutatsioonid olid teineteisest lahutatavad rekombinatsiooni teel, mistõttu enne 1940-ndaid aastaid valitsenud geneetilise kontseptsiooni alusel ei saanud neid käsitleda sama geeni erinevate alleelidena (alles hiljem selgus, et rekombinatsioon toimub ka geenisiseselt). Lewis ristas erinevaid mutante, kombineerides uuritavaid mutatsioone nii cis – kui trans-konfiguratsioonis, ja selgus, et tunnuse avaldumine (silma värvus) sõltus mutatsioonide asukohast, sellest kas need paiknesid ühes või kahes erinevas X kromosoomis. Metsiktüüpi fenotüüp (valgesilmsus) avaldus ainult cis-heterosügootidel. Trans-heterosügoodid olid mutantse fenotüübiga (heledad, kergelt aprikoosivarjundiga silmad).   

 

Benzer võttis kasutusele termini tsistron, tähistamaks üksust, mille avaldumist testitakse cis ja trans-komplementatsioonidega. Sisuliselt on see mõiste geeni sünonüüm. Geneetilistes katsetes on geen üks funktsionaalne üksus komplementatsioonitestis (trans-testis), mis ei võimalda trans-heterosügootidel avalduda metsiktüüpi fenotüübil juhul, kui kaks mutatsiooni paiknevad samas geenis.

 

Komplementatsioonitest ja rekombinatsioonitest annavad vastuseid erinevatele küsimustele

 

Komplementatsioonitest näitab, kas mutatsioonid paiknevad samas geenis e. kas nad on alleelsed (kumbki mutatsioon tekitab sama geeni erineva alleeli). Rekombinatsioonitesti abil uuritakse, kas mutatsioonid on aheldunud ja kui on, siis kui kaugel nad asuvad teineteisest kromosoomis (mutatsioonide omavahelist kaugust saab hinnata rekombinantide tekkesageduse kaudu). Komplementatsioonitesti korral jälgitakse, kas ristamisel saadud heterosügoodid on mutantse fenotüübiga või komplementeeritud, seega metsiktüüpi fenotüübiga. Rekombinatsioon võib toimuda nii vastastikku komplementeeritavate kui ka mittekomplementeeritavate tunnuste korral, kuid erineva sagedusega (rekombinatsioonisagedus on madalam, kui mutatsioonid asuvad lähestikku, näiteks samas geenis). Kahte uuritavat mutatsiooni, mille puhul ei teki rekombinante, kuna mutatsioonide asukoht kattub, nimetatakse struktuurseteks alleelideks. Mutatsioonid, mis on nii struktuurselt alleelsed (rekombinatsioonitesti põhjal ei teki rekombinante) kui ka funktsiooni alusel alleelsed (komplementatsioonitesti põhjal, ei komplementeeri teineteist vastastikku), nimetatakse homoalleelseteks mutatsioonideks. Seevastu mutatsioone, mis komplementatsioonitesti põhjal on alleelsed (ei komplementeeri), kuid struktuurselt mittealleelsed (annavad rekombinante), nimetatakse heteroalleelseteks mutatsioonideks. Mutantsed heteroalleelid sisaldavad mutatsioone sama geeni erinevates kohtades. 

 

Geenisiseste mutatsioonide komplementatsioon

 

Geenisiseste mutatsioonide komplementatsioon esineb mõnikord siis, kui on tegemist multimeersete valkudega, mis koosnevad kahest või enamast polüpeptiidist. Kui tegemist on valguga, mis koosneb sama geeni poolt kodeeritud polüpeptiididest (homodimeer, homotetrameer jne.), võivad kaks erinevat mutatsiooni sisaldavat polüpeptiidi ühe valgu koostises olles teineteise defekte osaliselt või täielikult komplementeerida. 

 

Komplementatsioonitesti piirangud

 

Komplementatsioonitest ei ole rakendatav sel juhul, kui uuritavad mutatsioonid on kas dominantsed või kodominantsed (avalduvad heterosügootses olekus), või kui on tegemist eelpoolkirjeldatud juhtumiga, kus toimub geenisiseste mutatsioonide komplementatsioon. Komplementatsioonitesti tulemuste analüüs on raskendatud ka epistaatiliste mutatsioonide puhul, kus üks mutatsioon mõjutab teise avaldumist. Epistaasi saab kindlaks teha cis-testi abil: epistaasi puhul on cis-heterosügoodid metsiktüüpi fenotüübi asemel mutantse fenotüübiga.

 

Komplementatsioonitesti kasutamine on raskendatud ka polaarsete mutatsioonide puhul. Polaarse mutatsiooni puhul mõjutab mutatsioon mitte üksnes selle geeni avaldumist, milles ta asub, vaid mõjutab ka temaga külgnevate geenide avaldumist. Need geenid paiknevad mutatsiooni sisaldavast geenist alati ühes kindlas suunas – sellest ka mutatsiooni polaarne toime. Näiteks bakterirakus paiknevad paljud struktuurgeenid operonina. Laktoosioperoni puhul paiknevad geenid lacZ (kodeerib laktoosi lagundavat ensüümi b-galaktosidaas) ja lacY (laktoosi permeaas järjekorras: lac-promootor – lacZ – lacY. Juhul, kui lacZ geeni algusosas tekib mutatsioon, mis tekitab sinna translatsiooni stop koodoni, mõjutab see oluliselt ka geeni lacY translatsiooni efektiivsust.

 

Komplekssed seosed geenide ja polüpeptiide vahel

 

Geenide ja polüpeptiidide kolineaarsus ei pruugi selle algses tähenduses alati kehtida. 1960-ndate aastate lõpus kirjeldati viirustel geenide kattuvust. Kattuvate geenide puhul peab arvestama, et osa samast nukleotiidsest järjestusest kuulub kahe või enama arvu geenide koostisesse. 1970-ndate lõpus ilmnes, et eukarüootsed geenid on katkestatud intronjärjestustega, mis on mittekodeerivad ning RNA splaissingu puhul on kirjeldatud ka alternatiivset spalissingut, kus sama pre-mRNA molekuli baasil saadud mRNA- erinevad üksteisest eksonite sisalduse poolest (selle tulemusena saadakse erinevate omadustega polüpeptiidid). Hiljem lisandus teave, et erinevaid antikehi (immunoglobuliine) kodeerivad järjestused saadakse erinevate geenisegmentide kombineerumise tulemusena.

 

Alternatiivne splaissing

 

Juhul, kui splaissingu tulemusena tekivad erinevad eksonite kombinatsioonid, mis kodeerivad erinevate omadustega valke (alternatiivne splaissing), käsitletakse geenina nukleotiidset järjestust, mis moodustab ühe transkriptsioonilise üksuse ja kodeerib erinevaid, omavahel suguluses olevaid valke, valgu isovorme.    Alternatiivset splaissingut on kirjeldatud näiteks imetajate b-globiini puhul ja kanade ovalbumiini puhul. Sel juhul võib algse pre-mRNA splaissingu tulemusena tekkida erineva pikkusega mRNA molekule, millest osadel on valikuliselt mõni eksonitest puudu. Nende mRNA-de pealt transleeritud polüpeptiidid on omavahel lähedalt suguluses, kuid erinevates variantides, valgu isovormides, on teatavad lõigud aminohappelisest järjestusest puudu. Iga konkreetse splaissitud mRNA molekuli ja tema poolt kodeeritava polüpeptiidi vahel säilib siiski kolineaarsus. Alternatiivne splaissing võib sageli olla koespetsiifiline. Näiteks imetajate tropomüosiini erinevad isovormid mõjutavad lihaste kontraktsiooni iseloomu. Loomade erinevates organites ja kehaosades on erinevad lihastüübid, mis sisaldavad erinevaid tropomüosiini isovorme. Hiirel on leitud vähemalt 10 selle valgu erinevat isovormi.

 

Geenisegmentide assambleerimine erinevaid immunoglobuliine kodeerivateks järjestusteks

 

Iga antikeha (immunoglobuliin, Ig), mis seondub spetsiifiliselt ainult tema poolt äratuntava bioloogilise võõrmaterjaliga (antigeeniga), koosneb neljast polüpeptiidahelast – kahest identsest raskest ahelast ja kahest identsest kergest ahelast. Kergeid ahelaid on kahte tüüpi (kapa ja lambda ahelad). Igas ahelas on konstantsed alad, mis on aminohappeliselt järjestuselt identsed sama klassi kuuluvate antikehade piires ning varieeruvad alad, mis on erinevaid antigeenseid determinante (epitoope) äratundvatel antikehade puhul erinevad. Tüvirakkudes, mis diferentseeruvad antikehi tootvateks B-lümfotsüütideks, on kromosoomis palju erinevaid geenisegmente, mida kombineeritakse rekombinatsiooni teel konstantse alaga. Näiteks inimese immunoglobuliini kapa kerget ahelat kodeeriv järjestus koosneb geenisegmentidest V, J ja C. V ja J on varieeruvad, C segment aga konstantne. Kõik geenisegmendid asuvad kromosoomis 2, kuid konkreetset kapa ahelat kodeeriv V-J-C järjestus saadakse alles geenisegmentide liitmise tulemusena. Algselt on kromosoomis 2 üle 300 V-segmendi, viis J-segmenti ning üks C-segment, mis kodeerivad kapa kerge ahela erinevaid osi. Lisaks segmentide kombineerumisele toimub varieeruvas regioonis pärast segmentide assambleerimist kõrge sagedusega mutagenees (somaatiline hüpermutagenees). See suurendab veelgi individuaalsete antikehade spetsiifikat. Iga B-lümfotsüüt toodab ainult ühte kindlat antikeha.

 

 

Kokkuvõtvalt võib öelda, et kaasaegse geeni käsitluse järgi on geen geneetilise informatsiooni üksus, mis määrab ära ühe polüpeptiidi või struktuurse RNA molekuli sünteesi. Geeni koostisesse kuuluvad ka 5´ ja 3´ mittekodeerivad regioonid, mis reguleerivad geeni transkriptsiooni ja translatsiooni ning geen hõlmab ka intronjärjestusi. Struktuurgeeni all mõeldakse DNA järjestust, millelt toimub transkriptsioon, RNA süntees. DNA järjestused, mis kodeerivad erinevaid antikehade segmente, ei vasta klassikalisele geeni definitsioonile ja sel puhul räägitakse geeni segmentidest, mis liidetakse ühtseks geeniks rekombinatsiooni teel.

 

 

 

    

 <tagasi